Amplicón

En biología molecular, un amplicón es un fragmento de ADN o ARN que es la fuente y/o producto de eventos de amplificación o replicación. Puede formarse artificialmente, utilizando varios métodos, incluidas las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) o las reacciones en cadena de la ligasa (LCR), o de forma natural mediante la duplicación de genes. En este contexto, amplificación se refiere a la producción de una o más copias de un fragmento genético o secuencia diana, específicamente el amplicón. Como se refiere al producto de una reacción de amplificación, amplicón se usa indistintamente con términos comunes de laboratorio, como "producto de PCR".

La amplificación artificial se utiliza en investigación, medicina forense y medicina para fines que incluyen la detección y cuantificación de agentes infecciosos, la identificación de restos humanos y la extracción de genotipos del cabello humano.

La duplicación natural de genes juega un papel importante en la evolución. También está implicado en varias formas de cáncer humano, incluido el linfoma mediastínico primario de células B y el linfoma de Hodgkin. En este contexto, el término amplicón puede referirse tanto a una sección de ADN cromosómico que ha sido escindida, amplificada y reinsertada en otra parte del genoma, como a un fragmento de ADN extracromosómico conocido como doble minuto, cada uno de los cuales pueden estar compuestos por uno o más genes. La amplificación de los genes codificados por estos amplicones generalmente aumenta la transcripción de esos genes y, en última instancia, el volumen de proteínas asociadas.

Estructura

Los amplicones en general son secuencias genéticas de repetición directa (de cabeza a cola) o de repetición invertida (de cabeza a cabeza o de cola a cola), y pueden tener una estructura lineal o circular. Los amplicones circulares consisten en duplicaciones invertidas imperfectas recocidas en un círculo y se cree que surgen de amplicones lineales precursores.

Durante la amplificación artificial, la longitud del amplicón está dictada por los objetivos experimentales.

Tecnología

El análisis de amplicones ha sido posible gracias al desarrollo de métodos de amplificación como la PCR y, cada vez más, a tecnologías más baratas y de mayor rendimiento para la secuenciación de ADN o la secuenciación de próxima generación, como la secuenciación de semiconductores de iones, conocida popularmente como secuenciación de amplicones. marca del desarrollador, Ion Torrent.

Las tecnologías de secuenciación de ADN, como la secuenciación de próxima generación, han hecho posible estudiar amplicones en biología y genética del genoma, incluida la investigación genética del cáncer, la investigación filogenética y la genética humana. Por ejemplo, utilizando el gen 16S rRNA, que forma parte de cada genoma bacteriano y de arqueas y está altamente conservado, las bacterias se pueden clasificar taxonómicamente comparando la secuencia del amplicón con secuencias conocidas. Esto funciona de manera similar en el dominio fúngico con el gen 18S rRNA, así como con la región no codificante ITS1.

Independientemente del enfoque utilizado para amplificar los amplicones, se debe utilizar alguna técnica para cuantificar el producto amplificado. Generalmente, estas técnicas incorporan un paso de captura y un paso de detección, aunque la forma en que se incorporan estos pasos depende del ensayo individual.

Los ejemplos incluyen el ensayo de monitorización Amplicor VIH-1 (RT-PCR), que tiene la capacidad de reconocer el VIH en plasma; el VIH-1 QT (NASBA), que se utiliza para medir la carga viral plasmática amplificando un segmento del ARN del VIH; y amplificación mediada por transcripción, que emplea un ensayo de protección de hibridación para distinguir infecciones por Chlamydia trachomatis. En cada enfoque participan varios pasos de detección y captura para evaluar el producto de amplificación o amplicón. Con la secuenciación de amplicones, se concatenan y secuencian un gran número de amplicones diferentes resultantes de la amplificación de una muestra habitual. Después de que la clasificación del control de calidad se realiza mediante diferentes métodos, los recuentos de taxones idénticos representan su abundancia relativa en la muestra.

Aplicaciones

La PCR se puede utilizar para determinar el sexo a partir de una muestra de ADN humano. Los lugares de inserción del elemento Alu se seleccionan, amplifican y evalúan en términos de tamaño del fragmento. El ensayo de sexo utiliza AluSTXa para el cromosoma X, AluSTYa para el cromosoma Y, o tanto AluSTXa como AluSTYa, para reducir la posibilidad de error a una cantidad insignificante. El cromosoma insertado produce un fragmento grande cuando se amplifica la región homóloga. Los machos se distinguen por tener dos amplicones de ADN presentes, mientras que las hembras tienen un solo amplicón. El kit adaptado para llevar a cabo el método incluye un par de cebadores para amplificar el locus y opcionalmente reactivos de reacción en cadena de la polimerasa.

LCR se puede utilizar para diagnosticar la tuberculosis. La secuencia que contiene el antígeno proteico B está dirigida por cuatro cebadores oligonucleotídicos: dos para la cadena sentido y dos para la cadena antisentido. Los cebadores se unen uno al lado del otro, formando un segmento de ADN bicatenario que, una vez separado, puede servir como objetivo para futuras rondas de replicación. En este caso, el producto se puede detectar mediante el inmunoensayo enzimático de micropartículas (MEIA).