Alcohol deshidrogenasa

Alcohol deshidrogenasas (ADH) (EC 1.1.1.1) son un grupo de enzimas deshidrogenasas que se encuentran en muchos organismos y facilitan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con la reducción del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD⁺) a NADH. En humanos y muchos otros animales, sirven para descomponer alcoholes que de otro modo serían tóxicos, y también participan en la generación de grupos aldehído, cetona o alcohol útiles durante la biosíntesis de varios metabolitos. En levaduras, plantas y muchas bacterias, algunas alcohol deshidrogenasas catalizan la reacción opuesta como parte de la fermentación para garantizar un suministro constante de NAD⁺.

Evolución

La evidencia genética de las comparaciones de múltiples organismos mostró que se supone que una formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión, idéntica a una alcohol deshidrogenasa de clase III (ADH-3/ADH5), es la enzima ancestral de toda la familia ADH. Al principio de la evolución, era importante un método eficaz para eliminar el formaldehído tanto endógeno como exógeno y esta capacidad ha conservado la ancestral ADH-3 a lo largo del tiempo. La duplicación de genes de ADH-3, seguida de una serie de mutaciones, condujo a la evolución de otras ADH.

Se cree que la capacidad de producir etanol a partir del azúcar (que es la base de cómo se elaboran las bebidas alcohólicas) evolucionó inicialmente en la levadura. Aunque esta característica no es adaptativa desde el punto de vista energético, al producir alcohol en concentraciones tan altas que serían tóxicos para otros organismos, las células de levadura podrían eliminar efectivamente a su competencia. Dado que la fruta podrida puede contener más del 4% de etanol, los animales que comían la fruta necesitaban un sistema para metabolizar el etanol exógeno. Se pensó que esto explicaba la conservación de la ADH activa en etanol en especies distintas de la levadura, aunque ahora se sabe que la ADH-3 también tiene un papel importante en la señalización del óxido nítrico.

En humanos, la secuenciación del gen ADH1B (responsable de la producción de un polipéptido de alcohol deshidrogenasa) muestra varias variantes funcionales. En uno, hay un SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) que conduce a un residuo de histidina o de arginina en la posición 47 del polipéptido maduro. En la variante Histidina, la enzima es mucho más efectiva en la conversión antes mencionada. Sin embargo, la enzima responsable de la conversión de acetaldehído en acetato no se ve afectada, lo que conduce a tasas diferenciales de catálisis del sustrato y provoca una acumulación de acetaldehído tóxico, lo que provoca daño celular. Esto proporciona cierta protección contra el consumo excesivo de alcohol y la dependencia del alcohol (alcoholismo). Varios haplotipos que surgen de esta mutación están más concentrados en las regiones cercanas al este de China, una región también conocida por su baja tolerancia y dependencia del alcohol.

Se realizó un estudio para encontrar una correlación entre la distribución alélica y el alcoholismo, y los resultados sugieren que la distribución alélica surgió junto con el cultivo de arroz en la región hace entre 12 000 y 6000 años. En las regiones donde se cultivaba arroz, el arroz también se fermentaba en etanol. Esto llevó a la especulación de que una mayor disponibilidad de alcohol condujo al alcoholismo y al abuso, lo que resultó en una menor aptitud reproductiva. Aquellos con el alelo variante tienen poca tolerancia al alcohol, lo que reduce la posibilidad de dependencia y abuso. La hipótesis postula que aquellos individuos con la variante de la enzima histidina eran lo suficientemente sensibles a los efectos del alcohol que surgieron éxitos reproductivos diferenciales y los alelos correspondientes se transmitieron de generación en generación. La evolución darwiniana clásica actuaría para seleccionar contra la forma perjudicial de la enzima (variante Arg) debido al menor éxito reproductivo de los individuos que portan el alelo. El resultado sería una mayor frecuencia del alelo responsable de la enzima variante His en las regiones que habían estado bajo presión selectiva durante más tiempo. La distribución y frecuencia de la variante His sigue la expansión del cultivo de arroz a las regiones del interior de Asia, con frecuencias más altas de la variante His en las regiones que han cultivado arroz durante más tiempo. La distribución geográfica de los alelos parece ser, por lo tanto, el resultado de la selección natural contra individuos con menor éxito reproductivo, es decir, aquellos que portaban la variante alélica Arg y eran más susceptibles al alcoholismo. Sin embargo, la persistencia de la variante Arg en otras poblaciones argumenta que el efecto podría no ser fuerte.

Descubrimiento

Caballo LADH (Liver Alcohol Dehidrogenasa)

La primera alcohol deshidrogenasa (ADH) aislada se purificó en 1937 a partir de Saccharomyces cerevisiae (levadura de cerveza). Muchos aspectos del mecanismo catalítico de la enzima ADH del hígado de caballo fueron investigados por Hugo Theorell y colaboradores. La ADH fue también una de las primeras enzimas oligoméricas en las que se determinó su secuencia de aminoácidos y su estructura tridimensional.

A principios de 1960, se descubrió en moscas de la fruta del género Drosophila.

Propiedades

Las alcohol deshidrogenasas comprenden un grupo de varias isoenzimas que catalizan la oxidación de alcoholes primarios y secundarios a aldehídos y cetonas, respectivamente, y también pueden catalizar la reacción inversa. En los mamíferos, se trata de una reacción redox (reducción/oxidación) en la que interviene la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD⁺).

Oxidación de alcohol

Mecanismo de acción en humanos

Pasos

1. La unión de la coenzima NAD⁺
2. Inserción del sustrato de alcohol por coordinación a cinc(II) ion
3. Deprotonación de Su-51
4. Deprotonación de nicotinamida ribose
5. Deprotonación de Thr-48
6. Deprotonación del alcohol
7. Transferencia de Hydride del ion alkoxide al NAD⁺, conduciendo a la NADH y a un aldehído o ketone atado de zinc
8. Lanzamiento del producto aldehído.

El mecanismo en levaduras y bacterias es el inverso de esta reacción. Estos pasos están respaldados por estudios cinéticos.

Subunidades involucradas

El sustrato está coordinado con el zinc y esta enzima tiene dos átomos de zinc por subunidad. Uno es el sitio activo, que está involucrado en la catálisis. En el sitio activo, los ligandos son Cys-46, Cys-174, His-67 y una molécula de agua. La otra subunidad está involucrada con la estructura. En este mecanismo, el hidruro del alcohol pasa a NAD⁺. Las estructuras cristalinas indican que His-51 desprotona la nicotinamida ribosa, que desprotona Ser-48. Finalmente, el Ser-48 desprotona el alcohol, convirtiéndolo en un aldehído. Desde una perspectiva mecanicista, si la enzima agrega hidruro al frente de NAD⁺, el hidrógeno resultante se incorpora a la posición pro-R. Las enzimas que agregan hidruro a la superficie se consideran deshidrogenasas de Clase A.

Sitio activo

El sitio activo del alcohol deshidrogenasa

El sitio activo de la ADH1 humana (PDB:1HSO) consiste en un átomo de zinc, His-67, Cys-174, Cys-46, Thr-48, His-51, Ile-269, Val-292, Ala- 317 y Phe-319. En la isoforma de hígado de caballo comúnmente estudiada, Thr-48 es una Ser y Leu-319 es una Phe. El zinc coordina el sustrato (alcohol). El zinc está coordinado por Cys-46, Cys-174 e His-67. Leu-319, Ala-317, His-51, Ile-269 y Val-292 estabilizan NAD⁺ formando enlaces de hidrógeno. His-51 e Ile-269 forman enlaces de hidrógeno con los alcoholes en la nicotinamida ribosa. Phe-319, Ala-317 y Val-292 forman enlaces de hidrógeno con la amida en NAD⁺.

Sitio de zinc estructural

El motivo de unión estructural de zinc en la deshidrogenasa del alcohol de una simulación MD

Las alcohol deshidrogenasas de mamíferos también tienen un sitio de zinc estructural. Este ion Zn juega un papel estructural y es crucial para la estabilidad de la proteína. Las estructuras de los sitios de zinc catalítico y estructural en la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) como se revela en las estructuras cristalográficas, que se ha estudiado computacionalmente con química cuántica, así como con métodos clásicos de dinámica molecular. El sitio de zinc estructural está compuesto por cuatro ligandos de cisteína estrechamente espaciados (Cys97, Cys100, Cys103 y Cys111 en la secuencia de aminoácidos) colocados en un tetraedro casi simétrico alrededor del ion Zn. Un estudio reciente mostró que la interacción entre el zinc y la cisteína se rige principalmente por una contribución electrostática con una contribución covalente adicional a la unión.

Tipos

Humano

En los humanos, la ADH existe en múltiples formas como un dímero y está codificada por al menos siete genes diferentes. Hay cinco clases (I-V) de alcohol deshidrogenasa, pero las formas hepáticas que se usan principalmente en humanos son la clase 1. La clase 1 consta de subunidades α, β y γ que están codificadas por los genes ADH1A, ADH1B y ADH1C. La enzima está presente en altos niveles en el hígado y el revestimiento del estómago. Cataliza la oxidación del etanol a acetaldehído (etanal):

CH₃CH₂OH + NAD⁺ → CH₃CHO + NADH + H⁺

Esto permite el consumo de bebidas alcohólicas, pero su propósito evolutivo probablemente sea la descomposición de los alcoholes contenidos naturalmente en los alimentos o producidos por bacterias en el tracto digestivo.

Otro propósito evolutivo es el metabolismo reversible del retinol (vitamina A), un alcohol, a retinaldehído, también conocido como retinal, que luego se convierte irreversiblemente en ácido retinoico, que regula la expresión de cientos de genes.

La alcohol deshidrogenasa también está involucrada en la toxicidad de otros tipos de alcohol: por ejemplo, oxida el metanol para producir formaldehído y, en última instancia, ácido fórmico. Los seres humanos tienen al menos seis alcohol deshidrogenasas ligeramente diferentes. Cada uno es un dímero (es decir, consta de dos polipéptidos), y cada dímero contiene dos iones de zinc Zn²⁺. Uno de esos iones es crucial para el funcionamiento de la enzima: está ubicado en el sitio catalítico y mantiene el grupo hidroxilo del alcohol en su lugar.

La actividad de la alcohol deshidrogenasa varía entre hombres y mujeres, entre jóvenes y ancianos, y entre poblaciones de diferentes áreas del mundo. Por ejemplo, las mujeres jóvenes no pueden procesar el alcohol al mismo ritmo que los hombres jóvenes porque no expresan tanto la alcohol deshidrogenasa, aunque ocurre lo contrario entre las personas de mediana edad. El nivel de actividad puede no depender solo del nivel de expresión sino también de la diversidad alélica entre la población.

Los genes humanos que codifican las alcohol deshidrogenasas de clase II, III, IV y V son ADH4, ADH5, ADH7 y ADH6, respectivamente.

Levadura y bacterias

A diferencia de los humanos, la levadura y las bacterias (excepto las bacterias del ácido láctico y E. coli en ciertas condiciones) no fermentan la glucosa en lactato. En cambio, lo fermentan a etanol y CO₂. La reacción general se puede ver a continuación:

Glucose + 2 ADP + 2 Pi → 2 etanol + 2 CO₂ + 2 ATP + 2 H₂O

Alcohol Dehidrogenasa

En la levadura y muchas bacterias, la alcohol deshidrogenasa juega un papel importante en la fermentación: el piruvato resultante de la glucólisis se convierte en acetaldehído y dióxido de carbono, y el acetaldehído luego se reduce a etanol mediante una alcohol deshidrogenasa llamada ADH1. El propósito de este último paso es la regeneración de NAD⁺, para que la glucólisis generadora de energía pueda continuar. Los humanos explotan este proceso para producir bebidas alcohólicas, dejando que la levadura fermente varias frutas o granos. La levadura puede producir y consumir su propio alcohol.

La principal alcohol deshidrogenasa de la levadura es más grande que la humana y consta de cuatro subunidades en lugar de solo dos. También contiene zinc en su sitio catalítico. Junto con las alcohol deshidrogenasas de animales y humanos que contienen zinc, estas enzimas de levaduras y muchas bacterias forman la familia de las alcohol deshidrogenasas de "cadena larga".

La levadura de cerveza también tiene otra alcohol deshidrogenasa, ADH2, que evolucionó a partir de una versión duplicada del cromosoma que contiene el gen ADH1. La levadura utiliza ADH2 para convertir el etanol nuevamente en acetaldehído, y se expresa solo cuando la concentración de azúcar es baja. Tener estas dos enzimas permite que la levadura produzca alcohol cuando el azúcar es abundante (y este alcohol luego mata a los microbios competidores), y luego continúa con la oxidación del alcohol una vez que el azúcar y la competencia desaparecen.

Plantas

En las plantas, la ADH cataliza la misma reacción que en la levadura y las bacterias para garantizar un suministro constante de NAD⁺. El maíz tiene dos versiones de ADH - ADH1 y ADH2, Arabidopsis thaliana contiene solo un gen ADH. La estructura de la ADH de Arabidopsis está conservada en un 47 %, en relación con la ADH del hígado de caballo. Sin embargo, se conservan residuos estructural y funcionalmente importantes, como los siete residuos que proporcionan ligandos para los átomos de zinc catalíticos y no catalíticos, lo que sugiere que las enzimas tienen una estructura similar. La ADH se expresa constitutivamente a niveles bajos en las raíces de las plantas jóvenes cultivadas en agar. Si las raíces carecen de oxígeno, la expresión de ADH aumenta significativamente. Su expresión también aumenta en respuesta a la deshidratación, a las bajas temperaturas y al ácido abscísico, y juega un papel importante en la maduración de frutos, desarrollo de plántulas y desarrollo de polen. Las diferencias en las secuencias de ADH en diferentes especies se han utilizado para crear filogenias que muestran cuán estrechamente relacionadas están las diferentes especies de plantas. Es un gen ideal para usar debido a su tamaño conveniente (2–3 kb de longitud con una secuencia de codificación de ≈1000 nucleótidos) y bajo número de copias.

Con contenido de hierro

Una tercera familia de alcohol deshidrogenasas, no relacionada con las dos anteriores, son las que contienen hierro. Se encuentran en bacterias y hongos. En comparación con las enzimas de las familias anteriores, estas enzimas son sensibles al oxígeno. Los miembros de la familia de alcohol deshidrogenasa que contiene hierro incluyen:

• Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa 4 (gene ADH4)
• Zymomonas mobilis alcohol deshidrogenasa 2 (gene adhB)
• Escherichia coli propanediol oxidoreductase EC 1.1.1.77 (gene fucO), una enzima implicada en el metabolismo de la fucosa y que también parece contener iones ferrosos.
• Clostridium acetobutylicum NADPH- y NADH-dependientes butanol dehidrogenas EC 1.1.1.- (genes adh1, bdhA y bdhB), enzimas que tienen actividad utilizando butanol y etanol como sustratos.
• E. coli adhE, una enzima dependiente de hierro que alberga tres actividades diferentes: deshidrogenasa de alcohol, acetaldehído deshidrogenasa (acetilización) EC 1.2.1.10 y desactivación de pyruvate-formate-lyase.
• Bacterial glycerol dehydrogenase EC 1.1.1.6 (gene gldA o dhaD).
• Clostridium kluyveri NAD-dependiente 4-hidroxibutyrate deshidrogenasa (4hbd) EC 1.1.1.61
• Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae 1,3-propanediol dehydrogenase EC 1.1.1.202 (gene dhaT)
• Bacillus methanolicus NAD-dependiente metanol deshidrogenasa EC 1.1.1.244
• E. coli y Salmonella typhimurium proteína de uso de etanolmina eutG.
• E. coli hipotética proteína yia Sí.

Otros tipos

Otra clase de alcohol deshidrogenasas pertenece a las quinoenzimas y requiere cofactores quinoides (p. ej., pirroloquinolina quinona, PQQ) como aceptores de electrones unidos a enzimas. Un ejemplo típico de este tipo de enzima es la metanol deshidrogenasa de bacterias metilotróficas.

Aplicaciones

En la biotransformación, las alcohol deshidrogenasas se utilizan a menudo para la síntesis de estereoisómeros enantioméricamente puros de alcoholes quirales. A menudo, se puede lograr una alta quimioselectividad y enantioselectividad. Un ejemplo es la alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus brevis (LbADH), que se describe como un biocatalizador versátil. La alta quimioespecificidad se ha confirmado también en el caso de sustratos que presentan dos sitios redox potenciales. Por ejemplo, el cinamaldehído presenta tanto un doble enlace alifático como una función aldehído. A diferencia de los catalizadores convencionales, las alcohol deshidrogenasas pueden actuar selectivamente solo sobre estos últimos, produciendo exclusivamente alcohol cinamílico.

En las celdas de combustible, las alcohol deshidrogenasas se pueden usar para catalizar la descomposición del combustible para una celda de combustible de etanol. Los científicos de la Universidad de Saint Louis han utilizado alcohol deshidrogenasa con soporte de carbono con poli(verde de metileno) como ánodo, con una membrana de nafión, para lograr unos 50 μA/cm².

En 1949, E. Racker definió una unidad de actividad de alcohol deshidrogenasa como la cantidad que provoca un cambio en la densidad óptica de 0,001 por minuto en las condiciones estándar de ensayo. Recientemente, la definición internacional de unidad enzimática (E.U.) ha sido más común: una unidad de alcohol deshidrogenasa convertirá 1,0 μmol de etanol en acetaldehído por minuto a un pH de 8,8 a 25 °C.

Importancia clínica

Alcoholismo

Se han realizado estudios que muestran que las variaciones en la ADH que influyen en el metabolismo del etanol tienen un impacto en el riesgo de dependencia del alcohol. El efecto más fuerte se debe a variaciones en ADH1B que aumentan la velocidad a la que el alcohol se convierte en acetaldehído. Una de estas variantes es más común en personas del este de Asia y Medio Oriente, otra es más común en personas de África. Ambas variantes reducen el riesgo de alcoholismo, pero las personas pueden volverse alcohólicas a pesar de eso. Los investigadores han detectado tentativamente algunos otros genes asociados con el alcoholismo, y saben que deben quedar muchos más por encontrar. La investigación continúa con el fin de identificar los genes y su influencia en el alcoholismo.

Dependencia de drogas

La dependencia de las drogas es otro problema asociado con la ADH, que los investigadores creen que podría estar relacionado con el alcoholismo. Un estudio en particular sugiere que la dependencia a las drogas tiene siete genes ADH asociados, sin embargo, se necesita más investigación. La dependencia del alcohol y la dependencia de otras drogas pueden compartir algunos factores de riesgo, pero debido a que la dependencia del alcohol a menudo es comórbida con otras dependencias de drogas, la asociación de ADH con las otras dependencias de drogas puede no ser causal.

Envenenamiento

El fomepizol, un fármaco que inhibe de forma competitiva la alcohol deshidrogenasa, se puede utilizar en el contexto de toxicidad aguda por metanol o etilenglicol. Esto evita la conversión del metanol o el etilenglicol en sus metabolitos tóxicos (como el ácido fórmico, el formaldehído o el glicolato). El mismo efecto también se logra a veces con etanol, de nuevo por inhibición competitiva de ADH.

Metabolismo de fármacos

La alcohol deshidrogenasa descompone el fármaco hidroxizina en su metabolito activo cetirizina. Otros fármacos con grupos alcohólicos pueden metabolizarse de manera similar siempre que el impedimento estérico no impida que el alcohol alcance el sitio activo.