ADN polimerasa I

ADN polimerasa I (o Pol I) es una enzima que participa en el proceso de replicación del ADN procariótico. Descubierta por Arthur Kornberg en 1956, fue la primera ADN polimerasa conocida (y la primera conocida de cualquier tipo de polimerasa). Inicialmente se caracterizó en E. coli y es omnipresente en procariotas. En E. coli y muchas otras bacterias, el gen que codifica Pol I se conoce como polA. El E. coli Pol I está compuesta por 928 aminoácidos y es un ejemplo de enzima procesiva: puede catalizar secuencialmente múltiples pasos de polimerización sin liberar la plantilla monocatenaria. La función fisiológica de Pol I es principalmente apoyar la reparación del ADN dañado, pero también contribuye a conectar fragmentos de Okazaki eliminando los cebadores de ARN y reemplazando los ribonucleótidos con ADN.

Descubrimiento

En 1956, Arthur Kornberg y sus colegas descubrieron Pol I utilizando extractos de Escherichia coli (E. coli) para desarrollar un ensayo de síntesis de ADN. Los científicos agregaron timidina marcada con ¹⁴C para poder recuperar un polímero radiactivo de ADN, no de ARN. Para iniciar la purificación de la ADN polimerasa, los investigadores agregaron sulfato de estreptomicina al E. extracto de coli. Esto separó el extracto en un sobrenadante libre de ácido nucleico (fracción S) y un precipitado que contiene ácido nucleico (fracción P). La fracción P también contenía Pol I y factores termoestables esenciales para las reacciones de síntesis de ADN. Estos factores fueron identificados como nucleósidos trifosfatos, los componentes básicos de los ácidos nucleicos. La fracción S contenía múltiples desoxinucleósidos quinasas. En 1959, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Arthur Kornberg y Severo Ochoa "por su descubrimiento de los mecanismos implicados en la síntesis biológica del ácido ribonucleico y del ácido desoxirribonucleico".

Estructura y función

Estructura general

Pol I funciona principalmente en la reparación del ADN dañado. Estructuralmente, Pol I es miembro de la superfamilia de proteínas alfa/beta, que engloba proteínas en las que las hélices α y las hebras β se presentan en secuencias irregulares. E. coli DNA Pol I consta de múltiples dominios con tres actividades enzimáticas distintas. Tres dominios, a menudo denominados dominio del pulgar, el dedo y la palma, trabajan juntos para mantener la actividad de la ADN polimerasa. Un cuarto dominio junto al dominio de la palma contiene un sitio activo de exonucleasa que elimina los nucleótidos incorporados incorrectamente en un sitio de 3' a 5' dirección en un proceso conocido como revisión. Un quinto dominio contiene otro sitio activo de exonucleasa que elimina el ADN o el ARN en un formato de 5'. a 3' dirección y es esencial para la eliminación del cebador de ARN durante la replicación del ADN o del ADN durante los procesos de reparación del ADN.

E. coli produce 5 ADN polimerasas diferentes: ADN Pol I, ADN Pol II, ADN Pol III, ADN Pol IV y ADN Pol V. Las células eucariotas contienen 5 ADN polimerasas diferentes: α, β, γ, δ y ε. La ADN polimerasa β eucariota es más similar a E. coli DNA Pol I porque su función principal está asociada con la reparación del ADN, más que con la replicación. La ADN polimerasa β se utiliza principalmente en la reparación por escisión de bases y en la reparación por escisión de nucleótidos. Se han identificado un total de 15 ADN polimerasas humanas.

Similitud estructural y funcional con otras polimerasas

En la replicación del ADN, la cadena principal de ADN se extiende continuamente en la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, mientras que la cadena rezagada del ADN corre discontinuamente en la dirección opuesta a la de los fragmentos de Okazaki. Las ADN polimerasas tampoco pueden iniciar cadenas de ADN, por lo que deben iniciarse mediante segmentos cortos de ARN o ADN conocidos como cebadores. Para que se produzca la polimerización del ADN, se deben cumplir dos requisitos. En primer lugar, todas las ADN polimerasas deben tener tanto una cadena plantilla como una cadena cebadora. A diferencia del ARN, las ADN polimerasas no pueden sintetizar ADN a partir de una cadena plantilla. La síntesis debe ser iniciada por un segmento corto de ARN, conocido como cebador de ARN, sintetizado por Primase en el extremo 5' a 3' dirección. Luego, la síntesis de ADN se produce mediante la adición de un dNTP al extremo 3' grupo hidroxilo al final de la cadena de ADN o del cebador de ARN preexistente. En segundo lugar, las ADN polimerasas sólo pueden añadir nuevos nucleótidos a la cadena preexistente mediante enlaces de hidrógeno. Dado que todas las ADN polimerasas tienen una estructura similar, todas comparten un mecanismo de polimerasa catalizado por iones de dos metales. Uno de los iones metálicos activa el cebador 3' grupo hidroxilo, que luego ataca al grupo primario 5' fosfato del dNTP. El segundo ion metálico estabilizará la carga negativa del oxígeno saliente y posteriormente quelará los dos grupos fosfato salientes.

Las estructuras cristalinas de rayos X de los dominios de polimerasa de las ADN polimerasas se describen de forma análoga a las manos derechas humanas. Todas las ADN polimerasas contienen tres dominios. El primer dominio, que se conoce como "dominio de los dedos", interactúa con el dNTP y la base de plantilla emparejada. El "dominio de los dedos" también interactúa con la plantilla para posicionarla correctamente en el sitio activo. Conocido como "dominio palma", el segundo dominio cataliza la reacción de transferencia del grupo fosforilo. Por último, el tercer dominio, conocido como "dominio del pulgar", interactúa con el ADN bicatenario. El dominio exonucleasa contiene su propio sitio catalítico y elimina bases desapareadas. Entre las siete familias diferentes de ADN polimerasa, el "dominio palma" se conserva en cinco de estas familias. El "dominio de los dedos" y "dominio pulgar" no son consistentes en cada familia debido a la variación de los elementos de la estructura secundaria de diferentes secuencias.

Función

Pol I posee cuatro actividades enzimáticas:

1. A 5'→3' (para adelante) actividad de polimerasa de ADN dependiente del ADN, que requiere un sitio de inicio de 3' y una cadena de plantilla
2. A 3'→5' (reverso) actividad exonucleasa que media la corrección de pruebas
3. A 5'→3' (para adelante) actividad de exonucleasa mediando traducción de níquel durante la reparación de ADN.
4. A 5'→3' (para adelante) Actividad polimerasa de ADN dependiente del ARN. Pol I opera en plantillas de ARN con una eficiencia considerablemente menor (0.1–0,4%) de lo que hace plantillas de ADN, y esta actividad probablemente es de sólo importancia biológica limitada.

Para determinar si Pol I se usó principalmente para la replicación del ADN o en la reparación del daño del ADN, se realizó un experimento con una cepa mutante Pol I deficiente de E. coli. La cepa mutante que carecía de Pol I fue aislada y tratada con un mutágeno. La cepa mutante desarrolló colonias bacterianas que continuaron creciendo normalmente y que también carecían de Pol I. Esto confirmó que Pol I no era necesario para la replicación del ADN. Sin embargo, la cepa mutante también mostraba características que implicaban una sensibilidad extrema a ciertos factores que dañaban el ADN, como la luz ultravioleta. Por lo tanto, esto reafirmó que era más probable que Pol I estuviera involucrado en la reparación del daño del ADN que en la replicación del ADN.

Mecanismo

En el proceso de replicación, la RNasa H elimina el cebador de ARN (creado por primasa) de la cadena retrasada y luego la polimerasa I rellena los nucleótidos necesarios entre los fragmentos de Okazaki (ver Replicación del ADN) en un 5'→3' dirección, corrigiendo errores a medida que avanza. Es una enzima dependiente de plantilla: solo agrega nucleótidos que se emparejan correctamente con una cadena de ADN existente que actúa como plantilla. Es crucial que estos nucleótidos tengan la orientación y geometría adecuadas para emparejarse con la cadena plantilla de ADN, de modo que la ADN ligasa pueda unir los diversos fragmentos en una cadena continua de ADN. Los estudios de la polimerasa I han confirmado que diferentes dNTP pueden unirse al mismo sitio activo en la polimerasa I. La polimerasa I es capaz de discriminar activamente entre los diferentes dNTP solo después de sufrir un cambio conformacional. Una vez que se ha producido este cambio, Pol I verifica la geometría adecuada y la alineación adecuada del par de bases, formado entre el dNTP unido y una base coincidente en la cadena plantilla. La geometría correcta de los pares de bases A=T y G≡C son las únicas que pueden caber en el sitio activo. Sin embargo, es importante saber que uno de cada 10⁴ a 10⁵ nucleótidos se añade de forma incorrecta. Sin embargo, Pol I puede corregir este error en la replicación del ADN utilizando su método selectivo de discriminación activa.

A pesar de su caracterización temprana, rápidamente se hizo evidente que la polimerasa I no era la enzima responsable de la mayor parte de la síntesis de ADN: la replicación del ADN en E. coli procede a aproximadamente 1.000 nucleótidos/segundo, mientras que la velocidad de síntesis de pares de bases por la polimerasa I promedia sólo entre 10 y 20 nucleótidos/segundo. Además, su abundancia celular de aproximadamente 400 moléculas por célula no se correlaciona con el hecho de que normalmente sólo hay dos horquillas de replicación en E. coli. Además, no es lo suficientemente procesivo para copiar un genoma completo, ya que se cae después de incorporar sólo entre 25 y 50 nucleótidos. Su papel en la replicación quedó demostrado cuando, en 1969, John Cairns aisló un mutante viable de la polimerasa I que carecía de actividad polimerasa. Cairns' La asistente de laboratorio, Paula De Lucia, creó miles de extractos libres de células de E. coli y se analizó su actividad ADN-polimerasa. El clon número 3.478 contenía el mutante polA, que fue nombrado por Cairns en honor a "Paula" [De Lucía]. No fue hasta el descubrimiento de la ADN polimerasa III que finalmente se identificó la principal ADN polimerasa replicativa.

Aplicaciones de investigación

ADN polimerasa que obtuve de E. coli se utiliza ampliamente para la investigación de biología molecular. Sin embargo, el 5'→3' La actividad exonucleasa lo hace inadecuado para muchas aplicaciones. Esta actividad enzimática indeseable puede eliminarse simplemente de la holoenzima para dejar una molécula útil llamada fragmento de Klenow, ampliamente utilizada en biología molecular. De hecho, el fragmento de Klenow se utilizó durante los primeros protocolos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hasta que en 1976 se descubrió Thermus acuáticos, la fuente de una Taq Polimerasa I tolerante al calor. polimerasa I a la proteasa subtilisina escinde la molécula en un fragmento más pequeño, que conserva sólo la ADN polimerasa y las actividades de corrección.