ADN complementario
En genética, el ADN complementario (ADNc) es ADN sintetizado a partir de una plantilla de ARN monocatenario (por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o microARN (miARN)) en una reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa. El ADNc se usa a menudo para expresar una proteína específica en una célula que normalmente no expresa esa proteína (es decir, expresión heteróloga), o para secuenciar o cuantificar moléculas de ARNm usando métodos basados en ADN (qPCR, RNA-seq). El ADNc que codifica una proteína específica se puede transferir a una célula receptora para su expresión, a menudo sistemas de expresión bacterianos o de levadura. El ADNc también se genera para analizar perfiles transcriptómicos en tejido a granel, células individuales o núcleos individuales en ensayos como micromatrices, qPCR y RNA-seq.
Los retrovirus (como el VIH-1, el VIH-2, el virus de la inmunodeficiencia de los simios, etc.) también producen de forma natural el ADNc, que luego se integra en el genoma del huésped, donde crea un provirus.
El término ADNc también se usa, normalmente en un contexto bioinformático, para referirse a una secuencia de transcripción de ARNm, expresada como bases de ADN (desoxi-GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).
Síntesis
El ARN sirve como molde para la síntesis de ADNc. En la vida celular, el ADNc es generado por virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico diana. En biología molecular, el ARN se purifica del material de origen después de eliminar el ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares. A continuación, el cDNA se sintetiza a través de la transcripción inversa in vitro.
Purificación de ARN
El ARN se transcribe a partir del ADN genómico en las células huésped y se extrae primero lisando las células y luego purificando el ARN utilizando métodos ampliamente utilizados, como fenol-cloroformo, columna de sílice y métodos de extracción de ARN basados en perlas. Los métodos de extracción varían según el material de origen. Por ejemplo, la extracción de ARN de tejido vegetal requiere reactivos adicionales, como polivinilpirrolidona (PVP), para eliminar compuestos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos que, de lo contrario, inutilizarían el ARN. Para eliminar el ADN y las proteínas, se utilizan enzimas como la DNasa y la Proteinasa K para la degradación. Es importante destacar que la integridad del ARN se mantiene mediante la inactivación de las ARNasas con agentes caotrópicos como el isotiocianato de guanidinio, el dodecilsulfato de sodio (SDS), el fenol o el cloroformo. Luego, el ARN total se separa de otros componentes celulares y se precipita con alcohol. Existen varios kits comerciales para extracciones de ARN simples y rápidas para aplicaciones específicas. Se pueden utilizar métodos adicionales basados en perlas para aislar subtipos específicos de ARN... (por ejemplo, ARNm y microARN) según el tamaño o las regiones de ARN únicas.
Transcripción inversa
Síntesis de la primera cadena
Usando una enzima transcriptasa inversa y plantillas de ARN purificadas, se produce una cadena de ADNc (síntesis de ADNc de la primera cadena). La transcriptasa inversa M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney se usa comúnmente debido a su actividad reducida de RNasa H adecuada para la transcripción de ARN más largos. La transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también se puede utilizar para moldes de ARN con estructuras secundarias fuertes (es decir, alta temperatura de fusión). El ADNc se genera comúnmente a partir de ARNm para análisis de expresión génica, como RT-qPCR y RNA-seq. El ARNm se transcribe inversamente de forma selectiva utilizando cebadores oligo-dT que son el complemento inverso de la cola poliadenilada en el extremo 3' final de todo el ARNm. Una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores de hexámeros aleatorios aumenta la posibilidad de obtener ADNc de longitud completa al tiempo que reduce 5' o 3' prejuicio. El ARN ribosómico también se puede agotar para enriquecer tanto el ARNm como los transcritos no poliadenilados, como algunos ARN no codificantes.
Síntesis de segunda cadena
El resultado de la síntesis de la primera cadena, los híbridos de ARN-ADN, se puede procesar a través de múltiples métodos de síntesis de la segunda cadena o procesarse directamente en ensayos posteriores. Un método temprano conocido como síntesis cebada en horquilla se basaba en la formación de horquilla en el 3' extremo de la primera cadena de cDNA para iniciar la síntesis de la segunda cadena. Sin embargo, el cebado es aleatorio y la hidrólisis en horquilla conduce a la pérdida de información. El procedimiento de Gubler y Hoffman utiliza la RNasa H de E. Coli para cortar el ARNm que se reemplaza con la ADN polimerasa I de E. Coli y se sella con la ADN ligasa de E. Coli. Una optimización de este procedimiento se basa en la baja actividad de la RNasa H de M-MLV para cortar el ARNm y luego eliminar el ARN restante agregando RNasa H después de la traducción de la ADN polimerasa de la segunda cadena de ADNc. Esto evita la pérdida de información de secuencia en el 5' extremo del ARNm.
Aplicaciones
El ADN complementario se usa a menudo en la clonación de genes o como sondas de genes o en la creación de una biblioteca de ADNc. Cuando los científicos transfieren un gen de una célula a otra célula para expresar el nuevo material genético como una proteína en la célula receptora, el ADNc se agregará al receptor (en lugar del gen completo), porque el ADN de un gen completo puede incluir ADN que no codifica la proteína o que interrumpe la secuencia de codificación de la proteína (p. ej., intrones). Las secuencias parciales de ADNc se obtienen a menudo como etiquetas de secuencias expresadas.
Con la amplificación de secuencias de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ahora común, normalmente se realizará la transcripción inversa como un paso inicial, seguida de PCR para obtener una secuencia exacta de ADNc para la expresión intracelular. Esto se logra mediante el diseño de cebadores de ADN específicos de secuencia que se hibridan con el 5' y 3' extremos de una región de ADNc que codifica una proteína. Una vez amplificada, la secuencia puede cortarse en cada extremo con nucleasas e insertarse en una de las muchas pequeñas secuencias circulares de ADN conocidas como vectores de expresión. Dichos vectores permiten la autorreplicación, dentro de las células, y potencialmente la integración en el ADN del huésped. Por lo general, también contienen un promotor fuerte para impulsar la transcripción del ADNc objetivo en ARNm, que luego se traduce en proteína.
El 13 de junio de 2013, la Corte Suprema de los Estados Unidos dictaminó en el caso de la Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, si bien los genes humanos naturales no se pueden patentar, el cDNA es elegible para patente porque no no ocurrir naturalmente.
cDNA también se utiliza para estudiar la expresión génica a través de métodos como RNA-seq o RT-qPCR. Para la secuenciación, el ARN debe estar fragmentado debido a las limitaciones de tamaño de la plataforma de secuenciación. Además, el ADNc sintetizado de la segunda cadena debe ligarse con adaptadores que permitan que los fragmentos de ADNc se amplifiquen por PCR y se unan a las células de flujo de secuenciación. Los métodos de análisis específicos de genes suelen utilizar micromatrices y RT-qPCR para cuantificar los niveles de ADNc mediante métodos fluorométricos y de otro tipo.
Virus y retrotransposones
Algunos virus también usan ADNc para convertir su ARN viral en ARNm (ARN viral → ADNc → ARNm). El ARNm se utiliza para producir proteínas virales que toman el control de la célula huésped.
Un ejemplo de este primer paso del ARN viral al ADNc se puede ver en el ciclo de infección del VIH. Aquí, la membrana de la célula huésped se adhiere a la envoltura lipídica del virus, lo que permite que la cápside viral con dos copias del ARN del genoma viral ingrese al huésped. La copia de ADNc se realiza luego a través de la transcripción inversa del ARN viral, un proceso facilitado por la chaperona CypA y una transcriptasa inversa asociada a la cápside viral.
El cDNA también es generado por retrotransposones en genomas eucarióticos. Los retrotransposones son elementos genéticos móviles que se mueven dentro y, a veces, entre genomas a través de intermediarios de ARN. Este mecanismo es compartido con los virus con exclusión de la generación de partículas infecciosas.