5-metilcitosina

5-metilcitosina es una forma metilada de la citosina base del ADN (C) que regula la transcripción de genes y desempeña otras funciones biológicas. Cuando la citosina está metilada, el ADN mantiene la misma secuencia, pero la expresión de los genes metilados puede verse alterada (el estudio de esto forma parte del campo de la epigenética). La 5-metilcitosina se incorpora al nucleósido 5-metilcitidina.

En la 5-metilcitosina, un grupo metilo está unido al quinto átomo en el anillo de 6 átomos, contando en sentido antihorario desde el nitrógeno unido a NH en la posición de las seis en punto. Este grupo metilo distingue a la 5-metilcitosina de la citosina.

Descubrimiento

Mientras intentaba aislar la toxina bacteriana responsable de la tuberculosis, W.G. Ruppel aisló un nuevo ácido nucleico llamado ácido tuberculínico en 1898 a partir del bacilo tuberculoso. Se encontró que el ácido nucleico era inusual, ya que contenía además de timina, guanina y citosina, un nucleótido metilado. En 1925, Johnson y Coghill detectaron con éxito una pequeña cantidad de un derivado de citosina metilado como producto de la hidrólisis del ácido tuberculínico con ácido sulfúrico. Este informe fue severamente criticado porque su identificación se basó únicamente en las propiedades ópticas del picrato cristalino, y otros científicos no lograron reproducir el mismo resultado. Pero su existencia finalmente se demostró en 1948, cuando Hotchkiss separó los ácidos nucleicos del ADN del timo de ternera mediante cromatografía en papel, mediante la cual detectó una citosina metilada única, bastante distinta de la citosina y el uracilo convencionales. Después de siete décadas, resultó que también es una característica común en diferentes moléculas de ARN, aunque el papel exacto es incierto.

En vivo

La función de este químico varía significativamente entre especies:

• En bacterias, 5-metilcitosina se puede encontrar en una variedad de sitios, y a menudo se utiliza como marcador para proteger el ADN de ser cortado por enzimas de restricción sensibles a la metilación nativa.
• En las plantas, se produce 5-metilcitosina en secuencias CpG, CpHpG y CpHpH (donde H = A, C o T).
• En hongos y animales, predomina la metilcitosina en los dinucleótidos CpG. La mayoría de los eucariotas metilan sólo un pequeño porcentaje de estos sitios, pero el 70-80% de los citocinas CpG se metilan en vertebrados. En las células mamíferas, los racimos de CpG en los 5' extremos de los genes se denominan islas CpG. 1% de todo ADN mamífero es 5mC.

Mientras que la desaminación espontánea de la citosina forma uracilo, que es reconocido y eliminado por las enzimas de reparación del ADN, la desaminación de la 5-metilcitosina forma timina. Esta conversión de una base de ADN de citosina (C) a timina (T) puede resultar en una mutación de transición. Además, la desaminación enzimática activa de citosina o 5-metilcitosina por parte de la familia de citosina desaminasas APOBEC podría tener implicaciones beneficiosas en varios procesos celulares, así como en la evolución del organismo. Las implicaciones de la desaminación en 5-hidroximetilcitosina, por otro lado, siguen siendo menos conocidas.

In vitro

El grupo NH₂ se puede eliminar (desaminación) de la 5-metilcitosina para formar timina con el uso de reactivos como el ácido nitroso; la citosina se desamina a uracilo (U) en condiciones similares.

Deamination of 5-methylcytosine to thymine

5-metilcitosina es resistente a la desaminación por tratamiento con bisulfito, que desamina los residuos de citosina. Esta propiedad a menudo se aprovecha para analizar patrones de metilación de citosina de ADN con secuenciación de bisulfito.

Adición y regulación con DNMTs (Eukaryotes)

Las marcas de 5 mC se colocan en el ADN genómico mediante ADN metiltransferasas (DNMT). Hay 5 DNMT en humanos: DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B y DNMT3L, y en algas y hongos están presentes 3 más (DNMT4, DNMT5 y DNMT6). DNMT1 contiene la secuencia dirigida a focos de replicación (RFTS) y el dominio CXXC que catalizan la adición de marcas de 5mC. RFTS dirige DNMT1 a loci de replicación de ADN para ayudar en el mantenimiento de 5 mC en las hebras hijas durante la replicación de ADN, mientras que CXXC contiene un dominio de dedo de zinc para la adición de novo de metilación al ADN. Se encontró que DNMT1 era la ADN metiltransferasa predominante en todos los tejidos humanos. Principalmente, DNMT3A y DNMT3B son responsables de la metilación de novo, y DNMT1 mantiene la marca de 5 mC después de la replicación. Los DNMT pueden interactuar entre sí para aumentar la capacidad de metilación. Por ejemplo, 2 DNMT3L puede formar un complejo con 2 DNMT3A para mejorar las interacciones con el ADN, facilitando la metilación. Los cambios en la expresión de DNMT dan como resultado una metilación aberrante. La sobreexpresión produce un aumento de la metilación, mientras que la alteración de la enzima reduce los niveles de metilación.

Adición del grupo de metil a la citosina

El mecanismo de la adición es el siguiente: primero, un residuo de cisteína en el motivo PCQ de la DNMT crea un ataque nucleofílico en el carbono 6 del nucleótido de citosina que se va a metilar. La S-adenosilmetionina luego dona un grupo metilo al carbono 5. Una base en la enzima DNMT desprotona el hidrógeno residual en el carbono 5 restaurando el doble enlace entre el carbono 5 y 6 en el anillo, produciendo el par de bases 5-metilcitosina.

Desmetilación

Después de que una citosina se metila a 5 mC, se puede revertir a su estado inicial a través de múltiples mecanismos. La desmetilación pasiva del ADN por dilución elimina la marca gradualmente mediante la replicación por falta de mantenimiento por parte de DNMT. En la desmetilación activa del ADN, una serie de oxidaciones lo convierte en 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC) y 5-carboxilcitosina (5caC), y las dos últimas finalmente son escindidas por la timina ADN glicosilasa (TDG), seguida de mediante reparación por escisión de base (BER) para restaurar la citosina. La eliminación de TDG produjo un aumento de 2 veces de 5fC sin ningún cambio estadísticamente significativo en los niveles de 5hmC, lo que indica que 5mC debe oxidarse iterativamente al menos dos veces antes de su desmetilación completa. La oxidación se produce a través de las dioxigenasas de la familia TET (Translocación Ten-Eleven) (enzimas TET) que pueden convertir 5mC, 5hmC y 5fC en sus formas oxidadas. Sin embargo, la enzima tiene la mayor preferencia por 5mC y la velocidad de reacción inicial para las conversiones de 5hmC y 5fC con TET2 es de 4,9 a 7,6 veces más lenta. TET requiere Fe (II) como cofactor y oxígeno y α-cetoglutarato (α-KG) como sustratos, y este último sustrato se genera a partir de isocitrato por la enzima isocitrato deshidrogenasa (IDH). Sin embargo, el cáncer puede producir 2-hidroxiglutarato (2HG) que compite con α-KG, lo que reduce la actividad de TET y, a su vez, reduce la conversión de 5mC a 5hmC.

Papel en humanos

En cáncer

En el cáncer, el ADN puede metilarse en exceso, lo que se denomina hipermetilación, y metilarse poco, lo que se denomina hipometilación. Los promotores de genes superpuestos de islas CpG se metilan de novo dando como resultado una inactivación aberrante de genes normalmente asociados con la inhibición del crecimiento de tumores (un ejemplo de hipermetilación). Al comparar el tejido tumoral y el normal, el primero tenía niveles elevados de las metiltransferasas DNMT1, DNMT3A y, en su mayoría, DNMT3B, todas las cuales están asociadas con los niveles anormales de 5 mC en el cáncer. Las secuencias repetidas en el genoma, incluido el ADN satélite, Alu y los elementos intercalados largos (LINE), a menudo se ven hipometilados en el cáncer, lo que da como resultado la expresión de estos genes normalmente silenciados, y los niveles suelen ser marcadores significativos de la progresión del tumor. Se ha planteado la hipótesis de que existe una conexión entre la hipermetilación y la hipometilación; la actividad excesiva de las metiltransferasas de ADN que producen la metilación anormal de novo 5mC puede compensarse mediante la eliminación de la metilación, un tipo de reparación epigenética. Sin embargo, la eliminación de la metilación es ineficiente, lo que da como resultado un exceso de hipometilación en todo el genoma. Lo contrario también puede ser posible; la sobreexpresión de la hipometilación puede ser silenciada por la hipermetilación de todo el genoma. Es probable que las capacidades distintivas del cáncer se adquieran a través de cambios epigenéticos que alteran los 5 mC tanto en las células cancerosas como en el estroma asociado al tumor circundante dentro del microambiente tumoral. Se ha informado que el medicamento contra el cáncer Cisplatin reacciona con 5mC.

Como biomarcador del envejecimiento

"Edad epigenética" se refiere a la conexión entre la edad cronológica y los niveles de metilación del ADN en el genoma. La combinación de los niveles de metilación del ADN, en conjuntos específicos de CpG llamados "CpG de reloj", con algoritmos que retroceden los niveles típicos de metilación colectiva del genoma en una edad cronológica dada, permite la predicción de la edad epigenética. Durante la juventud (0 a 20 años), los cambios en la metilación del ADN ocurren a un ritmo más rápido a medida que avanza el desarrollo y el crecimiento, y los cambios comienzan a disminuir a edades más avanzadas. Existen múltiples estimadores de edad epigenéticos. El reloj de Horvath mide un conjunto multitejido de 353 CpG, la mitad de los cuales se correlacionan positivamente con la edad y la otra mitad negativamente, para estimar la edad epigenética. El reloj de Hannum utiliza muestras de sangre de adultos para calcular la edad basándose en una base ortogonal de 71 CpG. El reloj de Levine, conocido como DNAm PhenoAge, depende de 513 CpG y supera a los otros estimadores de edad en la predicción de la mortalidad y la esperanza de vida, pero muestra un sesgo con los tejidos no sanguíneos. Hay reportes de estimadores de edad con el estado de metilación de solo una CpG en el gen ELOVL2. La estimación de la edad permite predecir la vida útil a través de las expectativas de las condiciones relacionadas con la edad a las que los individuos pueden estar sujetos en función de sus marcadores de metilación de 5 mC.

Literatura

• Griffiths, Anthony J. F. (1999). Introducción al análisis genético. W.H. Freeman. Capítulo 15: Mutación genética. ISBN 0-7167-3520-2. (disponible en línea en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de los Estados Unidos)