Superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) é uma enzima que catalisa alternadamente a dismutação (ou particionamento) do superóxido (O− 2) radical em oxigênio molecular comum (O2) e peróxido de hidrogênio ( H 2O 2). O superóxido é produzido como subproduto do metabolismo do oxigênio e, se não for regulado, causa muitos tipos de danos celulares. O peróxido de hidrogênio também é prejudicial e é degradado por outras enzimas, como a catalase. Assim, a SOD é uma importante defesa antioxidante em quase todas as células vivas expostas ao oxigênio. Uma exceção é o Lactobacillus plantarum e lactobacilos relacionados, que usam um mecanismo diferente para evitar danos causados por O− 2< /span>.
Reação química
SODs catalisam a desproporção do superóxido:
2H+ + 2- Sim. 2 → O 2 + H. H. H. 2O 2
Desta forma, O− 2 é convertido em duas espécies menos prejudiciais.
A forma geral, aplicável a todas as diferentes formas de SOD coordenadas por metal, pode ser escrita da seguinte forma:
M (n+1)- SOD + O- Sim. 2 → M Não.- SOD + O 2
M Não.- SOD + O- Sim. 2 + 2H+ → M (n+1)- SOD + H. H. H. 2O 2
As reações pelas quais a dismutação do superóxido catalisada por SOD para Cu,Zn SOD podem ser escritas como segue:
Cu2+ - SOD + O- Sim. 2 → Cu+ - SOD + O 2 (redução de cobre; oxidação de superóxido)
Cu+ - SOD + O- Sim. 2 + 2H+ → Cu2+ - SOD + H. H. H. 2O 2 (oxidação de cobre; redução de superóxido)
onde M = Cu (n=1); Mn (n=2); Fe (n=2); Ni (n=2) apenas em procariontes.
Em uma série de tais reações, o estado de oxidação e a carga do cátion metálico oscilam entre n e n+1: +1 e +2 para Cu, ou +2 e +3 para os outros metais.
Tipos
Geral
Irwin Fridovich e Joe McCord, da Duke University, descobriram a atividade enzimática da superóxido dismutase em 1968. As SODs eram anteriormente conhecidas como um grupo de metaloproteínas com função desconhecida; por exemplo, CuZnSOD era conhecido como eritrocupreína (ou hemocupreína, ou citocupreína) ou como medicamento antiinflamatório veterinário "Orgoteína". Da mesma forma, Brewer (1967) identificou uma proteína que mais tarde ficou conhecida como superóxido dismutase como uma indofenol oxidase por análise proteica de géis de amido usando a técnica de fenazina-tetrazólio.
Existem três famílias principais de superóxido dismutase, dependendo da dobra da proteína e do cofator metálico: o tipo Cu/Zn (que se liga ao cobre e ao zinco), os tipos Fe e Mn (que se ligam ao ferro ou ao manganês) e o tipo Ni (que liga o níquel).
Diagrama de fita da subunidade de SOD de Cu-Zn bovina
Local ativo de Human Manganese SOD, manganês mostrado em roxo
Dimers Mn-SOD vs Fe-SOD
Cobre e zinco – mais comumente usado por eucariotes, incluindo humanos. Os citosóis de praticamente todas as células eucarióticas contêm uma enzima SOD com cobre e zinco (Cu-Zn-SOD). Por exemplo, Cu-Zn-SOD disponível comercialmente é normalmente purificado de células vermelhas do sangue bovino. A enzima bovina Cu-Zn é um homodímero de peso molecular 32.500. Foi o primeiro SOD cuja estrutura de cristal de cauda atômica foi resolvida, em 1975. É um beta-barrel "chave grega" de 8 andares, com o local ativo mantido entre o barril e dois loops de superfície. As duas subunidades são firmemente unidas de volta para trás, principalmente por interações hidrofóbicas e eletrostáticas. Os ligantes do cobre e do zinco são seis histidina e uma lateral-chaínas aspartadas; uma histidina está ligada entre os dois metais.
Site ativo para superóxido de ferro dismutaseFerro ou manganês - usado por prokaryotes e protistas, e nas mitocôndrias e cloroplastos
Ferro – Muitas bactérias contêm uma forma da enzima com ferro (Fe-SOD); algumas bactérias contêm Fe-SOD, outras Mn-SOD, e algumas (como por exemplo, E. coli) conter ambos. Fe-SOD também pode ser encontrado nos cloroplastos das plantas. As estruturas 3D das dismutases homologous de superóxido de Mn e Fe têm o mesmo arranjo de alfa-helices, e seus locais ativos contêm o mesmo tipo e arranjo de cadeias laterais de aminoácidos. Eles são geralmente dimers, mas ocasionalmente tetramers.
Manganês – Quase todas as mitocôndrias e muitas bactérias, contêm uma forma com manganês (Mn-SOD): Por exemplo, o Mn-SOD encontrado nas mitocôndrias humanas. Os ligantes dos íons manganeses são 3 cadeias laterais de histidina, uma cadeia lateral aspartada e uma molécula de água ou ligante hidroxi, dependendo do estado de oxidação de Mn (respectivamente II e III).
Nickel – prokaryotic. Isso tem uma estrutura hexamérica (6-cópias) construída a partir de feixes 4-hélix de mão direita, cada um contendo ganchos N-terminal que mascaram um íon Ni. O Ni-hook contém o motivo His-Cys-X-X-Pro-Cys-Gly-X-Tyr; fornece a maioria das interações críticas para ligação e catálise de metal e é, portanto, um diagnóstico provável de NiSODs.
Em plantas superiores, as isoenzimas SOD foram localizadas em diferentes compartimentos celulares. Mn-SOD está presente nas mitocôndrias e nos peroxissomos. O Fe-SOD foi encontrado principalmente em cloroplastos, mas também foi detectado em peroxissomos, e o CuZn-SOD foi localizado no citosol, cloroplastos, peroxissomos e apoplasto.
Humano
Três formas de superóxido dismutase estão presentes em humanos, em todos os outros mamíferos e na maioria dos cordados. SOD1 está localizada no citoplasma, SOD2 nas mitocôndrias e SOD3 é extracelular. O primeiro é um dímero (consiste em duas unidades), enquanto os outros são tetrâmeros (quatro subunidades). SOD1 e SOD3 contêm cobre e zinco, enquanto SOD2, a enzima mitocondrial, possui manganês em seu centro reativo. Os genes estão localizados nos cromossomos 21, 6 e 4, respectivamente (21q22.1, 6q25.3 e 4p15.3-p15.1).
Plantas
Em plantas superiores, as enzimas superóxido dismutase (SODs) atuam como antioxidantes e protegem os componentes celulares da oxidação por espécies reativas de oxigênio (ROS). As ERO podem se formar como resultado de secas, lesões, herbicidas e pesticidas, ozônio, atividade metabólica das plantas, deficiências nutricionais, fotoinibição, temperatura acima e abaixo do solo, metais tóxicos e raios UV ou gama. Para ser mais específico, o O2 molecular é reduzido a O−< /sup> 2 (um ROS chamado superóxido) quando absorve um elétron excitado liberado de compostos da cadeia de transporte de elétrons. O superóxido é conhecido por desnaturar enzimas, oxidar lipídios e fragmentar DNA. SODs catalisam a produção de O2 e H 2O 2 do superóxido (O− 2), o que resulta em reagentes menos prejudiciais.
Ao se aclimatar a níveis elevados de estresse oxidativo, as concentrações de SOD normalmente aumentam com o grau das condições de estresse. A compartimentação de diferentes formas de SOD em toda a planta faz com que elas neutralizem o estresse de forma muito eficaz. Existem três classes bem conhecidas e estudadas de coenzimas metálicas SOD que existem nas plantas. Primeiro, os SODs de Fe consistem em duas espécies, um homodímero (contendo 1–2 g de Fe) e um tetrâmero (contendo 2–4 g de Fe). Acredita-se que sejam as metaloenzimas SOD mais antigas e são encontradas tanto em procariontes quanto em eucariotos. Os Fe SODs estão mais abundantemente localizados dentro dos cloroplastos das plantas, onde são indígenas. Em segundo lugar, os SODs de Mn consistem em uma espécie de homodímero e homotetrâmero, cada um contendo um único átomo de Mn(III) por subunidade. Eles são encontrados predominantemente nas mitocôndrias e nos peroxissomos. Terceiro, os SODs de Cu-Zn têm propriedades elétricas muito diferentes daquelas das outras duas classes. Estes estão concentrados no cloroplasto, no citosol e, em alguns casos, no espaço extracelular. Observe que os SODs de Cu-Zn fornecem menos proteção que os SODs de Fe quando localizados no cloroplasto.
Bactérias
Os glóbulos brancos humanos usam enzimas como a NADPH oxidase para gerar superóxido e outras espécies reativas de oxigênio para matar bactérias. Durante a infecção, algumas bactérias (por exemplo, Burkholderia pseudomallei) produzem, portanto, superóxido dismutase para se protegerem de serem mortas.
Bioquímica
SOD supera as reações prejudiciais do superóxido, protegendo assim a célula da toxicidade do superóxido.
A reação do superóxido com não radicais é proibida por spin. Em sistemas biológicos, isso significa que suas principais reações são consigo mesmo (dismutação) ou com outro radical biológico como o óxido nítrico (NO) ou com um metal da série de transição. O radical ânion superóxido (O− 2) se dismuta espontaneamente em O2 e peróxido de hidrogênio (< span class="chemf nowrap">H 2O 2) rapidamente (~105 M−1s−1 em pH 7). A SOD é necessária porque o superóxido reage com alvos celulares sensíveis e críticos. Por exemplo, reage com o radical NO e produz peroxinitrito tóxico.
Como a reação de dismutação não catalisada do superóxido requer que duas moléculas de superóxido reajam entre si, a taxa de dismutação é de segunda ordem em relação à concentração inicial de superóxido. Assim, a meia-vida do superóxido, embora muito curta em altas concentrações (por exemplo, 0,05 segundos a 0,1 mM), é na verdade bastante longa em baixas concentrações (por exemplo, 14 horas a 0,1 nM). Em contraste, a reação do superóxido com SOD é de primeira ordem em relação à concentração de superóxido. Além disso, a superóxido dismutase tem o maior kcat/KM (uma aproximação da eficiência catalítica) de qualquer enzima (~7 x 109 M−1s−1), sendo esta reação limitada apenas pela frequência de colisão entre ela e o superóxido. Ou seja, a taxa de reação é "limitada por difusão".
A alta eficiência da superóxido dismutase parece necessária: mesmo nas concentrações subnanomolares alcançadas pelas altas concentrações de SOD dentro das células, o superóxido inativa a enzima aconitase do ciclo do ácido cítrico, pode envenenar o metabolismo energético e libera ferro potencialmente tóxico. Aconitase é uma das várias (des)hidratases contendo ferro-enxofre em vias metabólicas que se mostram inativadas pelo superóxido.
Estabilidade e mecanismo de dobramento
SOD1 é uma proteína extremamente estável. Na forma holo (ligada ao cobre e ao zinco) o ponto de fusão é> 90°C. Na forma apo (sem ligação de cobre ou zinco), o ponto de fusão é de ~60 °C. Por calorimetria diferencial de varredura (DSC), o holo SOD1 se desdobra por um mecanismo de dois estados: de dímero para dois monômeros desdobrados. Em experimentos de desnaturação química, o holo SOD1 se desdobra por um mecanismo de três estados com observação de um intermediário monomérico dobrado.
Fisiologia
O superóxido é uma das principais espécies reativas de oxigênio na célula. Como consequência, a SOD desempenha um papel antioxidante fundamental. A importância fisiológica das SODs é ilustrada pelas patologias graves evidentes em camundongos geneticamente modificados para não possuírem essas enzimas. Ratos sem SOD2 morrem vários dias após o nascimento, em meio a um enorme estresse oxidativo. Camundongos sem SOD1 desenvolvem uma ampla gama de patologias, incluindo carcinoma hepatocelular, uma aceleração da perda de massa muscular relacionada à idade, uma incidência mais precoce de catarata e uma expectativa de vida reduzida. Camundongos sem SOD3 não apresentam defeitos óbvios e apresentam uma vida útil normal, embora sejam mais sensíveis a lesões hiperóxicas. Camundongos knockout de qualquer enzima SOD são mais sensíveis aos efeitos letais de compostos geradores de superóxido, como paraquat e diquat (herbicidas).
Drosophila sem SOD1 têm uma vida útil drasticamente reduzida, enquanto moscas sem SOD2 morrem antes do nascimento. A depleção de SOD1 e SOD2 no sistema nervoso e nos músculos da Drosophila está associada à redução da expectativa de vida. O acúmulo de ERO neuronais e musculares parece contribuir para deficiências associadas à idade. Quando a superexpressão de SOD2 mitocondrial é induzida, a vida útil da Drosophila adulta é prolongada.
Entre as formigas pretas de jardim (Lasius niger), a expectativa de vida das rainhas é uma ordem de magnitude maior do que a das operárias, apesar de não haver diferença sistemática na sequência de nucleotídeos entre elas. Descobriu-se que o gene SOD3 é o mais diferencialmente superexpresso nos cérebros das formigas rainhas e das operárias. Esta descoberta levanta a possibilidade de um papel importante da função antioxidante na modulação da expectativa de vida.
Nocautes de SOD no worm C. elegans não causam grandes perturbações fisiológicas. No entanto, a vida útil de C. elegans pode ser prolongada por miméticos de superóxido/catalase, sugerindo que o estresse oxidativo é um dos principais determinantes da taxa de envelhecimento.
Mutações knockout ou nulas em SOD1 são altamente prejudiciais ao crescimento aeróbio na levedura Saccharomyces cerevisiae e resultam em uma redução dramática na expectativa de vida pós-diáxica. Em S. cerevisiae de tipo selvagem, as taxas de danos ao DNA aumentaram 3 vezes com a idade, mas mais de 5 vezes em mutantes deletados para os genes SOD1 ou SOD2. Os níveis de espécies reativas de oxigênio aumentam com a idade nessas cepas mutantes e mostram um padrão semelhante ao padrão de aumento de danos no DNA com a idade. Assim, parece que a superóxido dismutase desempenha um papel substancial na preservação da integridade do genoma durante o envelhecimento em S. cerevisiae.
Nocaute de SOD2 ou mutações nulas causam inibição do crescimento em fontes respiratórias de carbono, além de diminuição da expectativa de vida pós-diáxica.
Na levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe, a deficiência da superóxido dismutase mitocondrial SOD2 acelera o envelhecimento cronológico.
Vários mutantes nulos de SOD procarióticos foram gerados, incluindo E. coli. A perda de CuZnSOD periplasmático causa perda de virulência e pode ser um alvo atraente para novos antibióticos.
Papel na doença
Mutações na primeira enzima SOD (SOD1) podem causar esclerose lateral amiotrófica familiar (ELA, uma forma de doença do neurônio motor). A mutação mais comum nos EUA é a A4V, enquanto a mais intensamente estudada é a G93A. A inativação da SOD1 causa carcinoma hepatocelular. A atividade diminuída da SOD3 tem sido associada a doenças pulmonares, como a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) ou a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A superóxido dismutase não é expressa nas células da crista neural do feto em desenvolvimento. Conseqüentemente, altos níveis de radicais livres podem causar danos a eles e induzir anomalias disráficas (defeitos do tubo neural).
Mutações na SOD1 podem causar ELA familiar (várias evidências também mostram que a SOD1 de tipo selvagem, sob condições de estresse celular, está implicada em uma fração significativa de casos esporádicos de ELA, que representam 90% dos pacientes com ELA). por um mecanismo que atualmente não é compreendido, mas não devido à perda de atividade enzimática ou a uma diminuição na estabilidade conformacional da proteína SOD1. A superexpressão de SOD1 tem sido associada aos distúrbios neurais observados na síndrome de Down. Em pacientes com talassemia, a SOD aumentará como forma de mecanismo de compensação. Porém, na fase crônica, a SOD não parece ser suficiente e tende a diminuir devido à destruição de proteínas a partir da reação massiva de oxidante-antioxidante.
Em camundongos, a superóxido dismutase extracelular (SOD3, ecSOD) contribui para o desenvolvimento da hipertensão. A inativação de SOD2 em camundongos causa letalidade perinatal.
Usos médicos
A suplementação de superóxido dimutase tem sido sugerida como tratamento para prevenir a displasia broncopulmonar em bebês que nascem prematuros, porém a eficácia de seu tratamento não é clara.
Pesquisa
SOD tem sido usado no tratamento experimental de inflamação crônica em condições inflamatórias do intestino. A SOD pode melhorar a nefrotoxicidade induzida pela cisplatina (estudos em roedores). Como "Orgoteína" ou "ontoseína", uma SOD de fígado bovino purificada e farmacologicamente ativa, também é eficaz no tratamento de doenças inflamatórias do trato urinário no homem. Durante algum tempo, a SOD de fígado bovino teve até aprovação regulatória em vários países europeus para tal uso. Isto foi interrompido por preocupações sobre a doença do príon.
Um agente mimético de SOD, TEMPOL, está atualmente em testes clínicos para radioproteção e prevenção de dermatite induzida por radiação. TEMPOL e nitróxidos similares miméticos de SOD exibem uma multiplicidade de ações em doenças que envolvem estresse oxidativo.
Usos cosméticos
A SOD pode reduzir os danos provocados pelos radicais livres na pele – por exemplo, para reduzir a fibrose após a radiação para o cancro da mama. Contudo, estudos deste tipo devem ser considerados provisórios, uma vez que não houve controlos adequados no estudo, incluindo a falta de aleatorização, dupla ocultação ou placebo. Sabe-se que a superóxido dismutase reverte a fibrose, possivelmente através da desdiferenciação de miofibroblastos de volta a fibroblastos.
Fontes comerciais
SOD é obtido comercialmente de fitoplâncton marinho, fígado bovino, raiz-forte, melão e certas bactérias. Para fins terapêuticos, a SOD geralmente é injetada localmente. Não há evidências de que a ingestão de SOD desprotegida ou de alimentos ricos em SOD possa ter quaisquer efeitos fisiológicos, uma vez que toda a SOD ingerida é decomposta em aminoácidos antes de ser absorvida. No entanto, a ingestão de SOD ligada às proteínas do trigo poderia melhorar a sua actividade terapêutica, pelo menos em teoria.
