Receptor acoplado à proteína G

A estrutura de sete-transmembrana α-helix da ródopsina bovina

Receptores acoplados à proteína G (GPCRs), também conhecidos como receptores de domínio transmembranar de sete (passagens), 7TM receptores, receptores heptahelicos, receptores serpentina e receptores ligados à proteína G (GPLR), formam um grande grupo de proteínas relacionadas evolutivamente que são receptores de superfície celular que detectam moléculas fora da célula e ativam respostas celulares. Eles são acoplados com proteínas G. Eles atravessam a membrana celular sete vezes na forma de seis alças (três alças extracelulares interagindo com moléculas de ligantes, três alças intracelulares interagindo com proteínas G, uma região extracelular N-terminal e uma região intracelular C-terminal) de resíduos de aminoácidos, que é por isso que às vezes são referidos como receptores de sete transmembranas. Os ligantes podem se ligar tanto ao N-terminal extracelular e loops (por exemplo, receptores de glutamato) quanto ao local de ligação dentro das hélices transmembrana (família semelhante à rodopsina). Todos são ativados por agonistas, embora também tenha sido observada uma autoativação espontânea de um receptor vazio.

Receptores acoplados à proteína G são encontrados apenas em eucariotos, incluindo leveduras, coanoflagelados e animais. Os ligantes que se ligam e ativam esses receptores incluem compostos sensíveis à luz, odores, feromônios, hormônios e neurotransmissores, e variam em tamanho de pequenas moléculas a peptídeos e grandes proteínas. Os receptores acoplados à proteína G estão envolvidos em muitas doenças.

Existem duas vias principais de transdução de sinal envolvendo os receptores acoplados à proteína G:

• o caminho do sinal cAMP e
• a via de sinal fosfatidylinositol.

Quando um ligante se liga ao GPCR, causa uma alteração conformacional no GPCR, o que permite que ele atue como um fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF). O GPCR pode então ativar uma proteína G associada trocando o GDP ligado à proteína G por um GTP. A subunidade α da proteína G, juntamente com o GTP ligado, pode então dissociar-se das subunidades β e γ para afetar ainda mais as proteínas de sinalização intracelular ou as proteínas funcionais alvo diretamente, dependendo do tipo de subunidade α (Gαs, Gαi/o, Gαq /11, Gα12/13).

Os GPCRs são um importante alvo de drogas e aproximadamente 34% de todas as drogas aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) têm como alvo 108 membros desta família. O volume global de vendas desses medicamentos é estimado em 180 bilhões de dólares americanos em 2018. Estima-se que os GPCRs sejam alvos de cerca de 50% dos medicamentos atualmente no mercado, principalmente devido ao seu envolvimento em vias de sinalização relacionadas a muitas doenças, ou seja, distúrbios mentais, metabólicos, incluindo endocrinológicos, imunológicos, incluindo infecções virais, cardiovasculares, inflamatórios, distúrbios dos sentidos e câncer. A associação há muito descoberta entre GPCRs e muitas substâncias endógenas e exógenas, resultando em e. analgesia, é outro campo de desenvolvimento dinâmico da pesquisa farmacêutica.

História e significado

Com a determinação da primeira estrutura do complexo entre um receptor acoplado à proteína G (GPCR) e um trímero de proteína G (Gαβγ) em 2011, um novo capítulo da pesquisa GPCR foi aberto para investigações estruturais de interruptores globais com mais mais de uma proteína a ser investigada. Os avanços anteriores envolveram a determinação da estrutura cristalina do primeiro GPCR, rodopsina, em 2000 e a estrutura cristalina do primeiro GPCR com um ligante difusível (β₂AR) em 2007. A maneira como o Sete hélices transmembrana de um GPCR estão dispostas em um feixe foi suspeitado com base no modelo de baixa resolução da rodopsina de sapo a partir de estudos de microscopia eletrônica criogênica dos cristais bidimensionais. A estrutura cristalina da rodopsina, que surgiu três anos depois, não surpreendeu, a não ser pela presença de uma hélice citoplasmática adicional H8 e a localização precisa de uma alça cobrindo o sítio de ligação da retina. No entanto, forneceu um andaime que se esperava ser um modelo universal para modelagem de homologia e design de drogas para outros GPCRs - uma noção que se mostrou muito otimista.

Sete anos depois, a cristalização do receptor β₂-adrenérgico (β₂AR) com um ligante difusível trouxe resultados surpreendentes porque revelou uma forma bastante diferente do lado extracelular do receptor do que o da rodopsina. Essa área é importante porque é responsável pela ligação do ligante e é alvo de muitos fármacos. Além disso, o sítio de ligação do ligante era muito mais espaçoso do que na estrutura da rodopsina e estava aberto para o exterior. Nos outros receptores cristalizados logo depois, o lado de ligação era ainda mais facilmente acessível ao ligante. Novas estruturas complementadas com investigações bioquímicas desvendaram mecanismos de ação de interruptores moleculares que modulam a estrutura do receptor levando a estados de ativação para agonistas ou a estados de inativação total ou parcial para agonistas inversos.

O Prêmio Nobel de Química de 2012 foi concedido a Brian Kobilka e Robert Lefkowitz por seu trabalho que foi "crucial para entender como funcionam os receptores acoplados à proteína G". Houve pelo menos sete outros Prêmios Nobel concedidos por algum aspecto da sinalização mediada pela proteína G. A partir de 2012, dois dos dez medicamentos mais vendidos no mundo (Advair Diskus e Abilify) atuam visando receptores acoplados à proteína G.

Classificação

Programa de Classificação de GPCRs em 2006. Desde então, mais genes foram encontrados. Class A (Rhodopsin-like), Class B (Secretin-like), Class C (Glutamate Receptor-like), Others (Adhesion (33), Frizzled (11), Taste type-2 (25), unclassified (23)).

O tamanho exato da superfamília GPCR é desconhecido, mas pelo menos 831 genes humanos diferentes (ou ~ 4% de todo o genoma codificador de proteínas) foram previstos para codificá-los a partir da análise da sequência do genoma. Embora numerosos esquemas de classificação tenham sido propostos, a superfamília foi classicamente dividida em três classes principais (A, B e C) sem homologia de sequência compartilhada detectável entre as classes.

A maior classe é de longe a classe A, que responde por quase 85% dos genes GPCR. Dos GPCRs de classe A, prevê-se que mais da metade deles codifique receptores olfativos, enquanto os receptores restantes são ligados por compostos endógenos conhecidos ou são classificados como receptores órfãos. Apesar da falta de homologia de sequência entre as classes, todos os GPCRs possuem uma estrutura comum e um mecanismo de transdução de sinal. O grande grupo rodopsina A foi subdividido em 19 subgrupos (A1-A19).

De acordo com o sistema A-F clássico, os GPCRs podem ser agrupados em 6 classes com base na homologia de sequência e similaridade funcional:

• Classe A (ou 1) (como Rhodopsin)
• Classe B (ou 2) (família de receptores de secretina)
• Classe C (ou 3) (glutamato metabotrópico/feno)
• Classe D (ou 4) (receptores de feromona de acasalamento angular)
• Classe E (ou 5) (receptores Ciclicos AMP)
• Classe F (ou 6) (Frizzled/Smoothened)

Mais recentemente, um sistema de classificação alternativo chamado GRAFS (Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2, Secretin) foi proposto para GPCRs de vertebrados. Eles correspondem às classes clássicas C, A, B2, F e B.

Um estudo inicial baseado na sequência de DNA disponível sugeriu que o genoma humano codifica cerca de 750 receptores acoplados à proteína G, cerca de 350 dos quais detectam hormônios, fatores de crescimento e outros ligantes endógenos. Aproximadamente 150 dos GPCRs encontrados no genoma humano têm funções desconhecidas.

Alguns servidores da web e métodos de predição de bioinformática têm sido usados para prever a classificação de GPCRs de acordo com sua sequência de aminoácidos apenas, por meio da abordagem de pseudo composição de aminoácidos.

Funções fisiológicas

Os GPCRs estão envolvidos em uma ampla variedade de processos fisiológicos. Alguns exemplos de seus papéis fisiológicos incluem:

1. O sentido visual: As opsinas usam uma reação de fotoisomerização para traduzir a radiação eletromagnética em sinais celulares. Rhodopsin, por exemplo, usa a conversão de 11-cis-retinal para todo-trans-retinal para este propósito.
2. O sentido gustativo (tarefa): GPCRs em células de gosto mediam a liberação de gustducin em resposta a substâncias amargas, umami- e doce-tasting.
3. O sentido do cheiro: Os receptores do epitélio olfatório ligam os odorantes (receptores olfativos) e feromônios (receptores vomeronasais)
4. Regulação comportamental e de humor: Os receptores no cérebro mamífero ligam vários neurotransmissores diferentes, incluindo serotonina, dopamina, histamina, GABA e glutamato
5. Regulação da atividade do sistema imunológico e inflamação: os receptores de chemokine ligam os ligantes que mediam a comunicação intercelular entre as células do sistema imunológico; os receptores tais como os receptores de histamina ligam mediadores inflamatórios e envolvem tipos de células-alvo na resposta inflamatória. GPCRs também estão envolvidos em imunomodulação, e. g. regulando indução de interleucina ou suprimindo respostas imunológicas induzidas por TLR de células T.
6. Transmissão automática do sistema nervoso: Ambos os sistemas nervosos simpáticos e parassimpáticos são regulados por vias GPCR, responsáveis pelo controle de muitas funções automáticas do corpo, tais como pressão arterial, freqüência cardíaca e processos digestivos
7. Sensor de densidade celular: Um novo papel GPCR na regulação da detecção da densidade celular.
8. modulação de Homeostasis (por exemplo, balanço de água).
9. Envolvido em crescimento e metástases de alguns tipos de tumores.
10. Usado no sistema endócrino para hormônios derivados peptídeos e amino-ácidos que se ligam a GCPRs na membrana celular de uma célula alvo. Isso ativa o cAMP, que por sua vez ativa várias quinases, permitindo uma resposta celular, como a transcrição.

Estrutura do receptor

GPCRs são proteínas integrais de membrana que possuem sete domínios transmembrana ou hélices transmembrana. As partes extracelulares do receptor podem ser glicosiladas. Essas alças extracelulares também contêm dois resíduos de cisteína altamente conservados que formam pontes dissulfeto para estabilizar a estrutura do receptor. Algumas proteínas de hélice de sete transmembranas (canalrodopsina) que se assemelham a GPCRs podem conter canais iônicos em suas proteínas.

Em 2000, a primeira estrutura cristalina de um GPCR de mamífero, a da rodopsina bovina (1F88), foi resolvida. Em 2007, a primeira estrutura de um GPCR humano foi solucionada. Essa estrutura GPCR do receptor β2-adrenérgico humano provou ser altamente semelhante à rodopsina bovina. As estruturas de GPCRs ativados ou ligados a agonistas também foram determinadas. Essas estruturas indicam como a ligação do ligante no lado extracelular de um receptor leva a mudanças conformacionais no lado citoplasmático do receptor. A maior mudança é um movimento para fora da parte citoplasmática da 5ª e 6ª hélice transmembranar (TM5 e TM6). A estrutura do receptor beta-2 adrenérgico ativado em complexo com G_s confirmou que o Gα se liga a uma cavidade criada por esse movimento.

Os GPCRs exibem uma estrutura semelhante a algumas outras proteínas com sete domínios transmembranares, como rodopsinas microbianas e receptores de adiponectina 1 e 2 (ADIPOR1 e ADIPOR2). No entanto, esses receptores e canais 7TMH (7 hélices transmembrana) não se associam às proteínas G. Além disso, ADIPOR1 e ADIPOR2 são orientados de forma oposta aos GPCRs na membrana (ou seja, os GPCRs geralmente têm um terminal N extracelular, terminal C citoplasmático, enquanto os ADIPORs são invertidos).

Relações estrutura-função

Esquema bidimensional de um GPCR genérico definido em uma Raft Lipid. Clique na imagem para maior resolução para ver detalhes sobre os locais de estruturas importantes.

Em termos de estrutura, os GPCRs são caracterizados por um N-terminal extracelular, seguido por sete α-hélices transmembranares (7-TM) (TM-1 a TM-7) conectadas por três intracelulares (IL-1 a IL- 3) e três alças extracelulares (EL-1 a EL-3) e, finalmente, um C-terminal intracelular. O GPCR se organiza em uma estrutura terciária semelhante a um barril, com as sete hélices transmembrana formando uma cavidade dentro da membrana plasmática que serve a um domínio de ligação ao ligante que é frequentemente coberto por EL-2. Os ligantes também podem se ligar em outros lugares, no entanto, como é o caso de ligantes mais volumosos (por exemplo, proteínas ou peptídeos grandes), que, em vez disso, interagem com as alças extracelulares ou, conforme ilustrado pelos receptores metabotrópicos de glutamato classe C (mGluRs), os N- cauda terminal. Os GPCRs de classe C se distinguem por sua grande cauda N-terminal, que também contém um domínio de ligação ao ligante. Após a ligação do glutamato a um mGluR, a cauda N-terminal sofre uma alteração conformacional que leva à sua interação com os resíduos das alças extracelulares e domínios TM. O efeito final de todos os três tipos de ativação induzida por agonistas é uma mudança nas orientações relativas das hélices TM (comparadas a um movimento de torção) levando a uma superfície intracelular mais ampla e à "revelação" de resíduos das hélices intracelulares e domínios TM cruciais para a função de transdução de sinal (isto é, acoplamento de proteína G). Agonistas e antagonistas inversos também podem se ligar a vários locais diferentes, mas o efeito final deve ser a prevenção dessa reorientação da hélice da MT.

A estrutura das caudas N- e C-terminal dos GPCRs também pode servir a funções importantes além da ligação do ligante. Por exemplo, o terminal C dos receptores muscarínicos M₃ é suficiente, e o domínio polibásico de seis aminoácidos (KKKRRK) no terminal C é necessário para sua pré-montagem com G_q proteínas. Em particular, o terminal C geralmente contém resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) que, quando fosforilados, aumentam a afinidade da superfície intracelular para a ligação de proteínas de andaime chamadas β-arrestinas (β-arr). Uma vez ligadas, as β-arrestinas previnem estericamente o acoplamento da proteína G e podem recrutar outras proteínas, levando à criação de complexos de sinalização envolvidos na ativação da via da quinase regulada por sinal extracelular (ERK) ou endocitose do receptor (internalização). Como a fosforilação desses resíduos de Ser e Thr geralmente ocorre como resultado da ativação de GPCR, o desacoplamento da proteína G mediada por β-arr e a internalização de GPCRs são mecanismos importantes de dessensibilização. Além disso, "mega-complexos" consistindo em um único GPCR, β-arr (na conformação da cauda) e proteína G heterotrimérica existem e podem ser responsáveis pela sinalização de proteína dos endossomos.

Um tema estrutural comum final entre os GPCRs é a palmitoilação de um ou mais locais da cauda C-terminal ou das alças intracelulares. A palmitoilação é a modificação covalente de resíduos de cisteína (Cys) por meio da adição de grupos acil hidrofóbicos e tem o efeito de direcionar o receptor para microdomínios ricos em colesterol e esfingolipídios da membrana plasmática chamados jangadas lipídicas. Como muitos dos transdutores a jusante e moléculas efetoras de GPCRs (incluindo aqueles envolvidos em vias de feedback negativo) também são direcionados para jangadas lipídicas, isso tem o efeito de facilitar a sinalização rápida do receptor.

Os GPCRs respondem a sinais extracelulares mediados por uma enorme diversidade de agonistas, variando de proteínas a aminas biogênicas a prótons, mas todos transduzem esse sinal por meio de um mecanismo de acoplamento à proteína G. Isso é possível por um domínio do fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) formado principalmente por uma combinação de IL-2 e IL-3 juntamente com resíduos adjacentes das hélices TM associadas.

Mecanismo

Desenhos animados que descrevem o conceito básico de ativação conformacional GPCR. Ligação ligand interrompe uma fechadura iônica entre o motivo E/DRY de TM-3 e resíduos ácidos de TM-6. Como resultado, o GPCR reorganiza para permitir a ativação de proteínas G-alfa. A perspectiva lateral é uma visão de cima e para o lado do GPCR como é definido na membrana plasmática (os lipídios da membrana foram omitidos para clareza). A perspectiva intracelular mostra a visão olhando para a membrana plasmática de dentro da célula.

O receptor acoplado à proteína G é ativado por um sinal externo na forma de um ligante ou outro mediador de sinal. Isso cria uma mudança conformacional no receptor, causando a ativação de uma proteína G. O efeito adicional depende do tipo de proteína G. As proteínas G são subsequentemente inativadas por proteínas ativadoras de GTPase, conhecidas como proteínas RGS.

Ligação do ligante

GPCRs incluem um ou mais receptores para os seguintes ligantes: mediadores de sinal sensorial (por exemplo, luz e moléculas estimuladoras olfativas); adenosina, bombesina, bradicinina, endotelina, ácido γ-aminobutírico (GABA), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), melanocortinas, neuropeptídeo Y, peptídeos opióides, opsinas, somatostatina, GH, taquicininas, membros da família de peptídeos intestinais vasoativos e vasopressina; aminas biogênicas (por exemplo, dopamina, epinefrina, norepinefrina, histamina, serotonina e melatonina); glutamato (efeito metabotrópico); glucagon; acetilcolina (efeito muscarínico); quimiocinas; mediadores lipídicos da inflamação (por exemplo, prostaglandinas, prostanóides, fator ativador de plaquetas e leucotrienos); hormônios peptídicos (por exemplo, calcitonina, anafilatoxina C5a, hormônio folículo-estimulante [FSH], hormônio liberador de gonadotropina [GnRH], neuroquinina, hormônio liberador de tireotropina [TRH] e oxitocina); e endocanabinóides.

GPCRs que atuam como receptores para estímulos que ainda não foram identificados são conhecidos como receptores órfãos.

No entanto, em contraste com outros tipos de receptores que foram estudados, em que os ligantes se ligam externamente à membrana, os ligantes de GPCRs normalmente se ligam dentro do domínio transmembranar. No entanto, os receptores ativados por protease são ativados pela clivagem de parte de seu domínio extracelular.

Mudança conformacional

Estrutura de cristal do receptor adrenérgico beta-2 ativado em complexo com G_S(PDB entrada 3SN6). O receptor é vermelho colorido, verde Gα, ciano Gβ e amarelo Gγ. O termo C de Gα está localizado em uma cavidade criada por um movimento exterior das partes citoplasmáticas de TM5 e 6.

A transdução do sinal através da membrana pelo receptor não é completamente compreendida. Sabe-se que no estado inativo, o GPCR está ligado a um complexo de proteína G heterotrimérica. A ligação de um agonista ao GPCR resulta em uma alteração conformacional no receptor que é transmitida à subunidade G_α ligada da proteína G heterotrimérica por meio da dinâmica do domínio da proteína. A subunidade G_α ativada troca GTP no lugar de GDP que, por sua vez, desencadeia a dissociação da subunidade G_α do dímero G_βγ e do receptor. As subunidades G_α e G_βγ dissociadas interagem com outras proteínas intracelulares para continuar a cascata de transdução de sinal enquanto o GPCR liberado é capaz de se religar a outra proteína G heterotrimérica para formar uma nova complexo que está pronto para iniciar outra rodada de transdução de sinal.

Acredita-se que uma molécula receptora existe em um equilíbrio conformacional entre estados biofísicos ativos e inativos. A ligação de ligantes ao receptor pode deslocar o equilíbrio em direção aos estados do receptor ativo. Existem três tipos de ligantes: Agonistas são ligantes que deslocam o equilíbrio em favor dos estados ativos; agonistas inversos são ligantes que deslocam o equilíbrio em favor de estados inativos; e antagonistas neutros são ligantes que não afetam o equilíbrio. Ainda não se sabe exatamente como os estados ativo e inativo diferem um do outro.

Ciclo de ativação/desativação da proteína G

Desenhos animados que retratam o ciclo de ativação/desativação da proteína G Heterotrimérico no contexto da sinalização GPCR

Quando o receptor está inativo, o domínio GEF pode estar ligado a uma subunidade α também inativa de uma proteína G heterotrimérica. Essas "G-proteínas" são um trímero de subunidades α, β e γ (conhecidos como Gα, Gβ e Gγ, respectivamente) que se torna inativo quando reversivelmente ligado ao difosfato de guanosina (GDP) (ou, alternativamente, nenhum nucleotídeo de guanina), mas ativo quando ligado a trifosfato de guanosina (GTP). Após a ativação do receptor, o domínio GEF, por sua vez, ativa alostericamente a proteína G, facilitando a troca de uma molécula de GDP por GTP na subunidade α da proteína G. A célula mantém uma proporção de 10:1 de GTP citosólico:GDP, de modo que a troca por GTP é assegurada. Neste ponto, as subunidades da proteína G dissociam-se do receptor, bem como entre si, para produzir um monômero Gα-GTP e um dímero Gβγ fortemente interativo, que agora estão livres para modular a atividade de outras proteínas intracelulares. A extensão em que eles podem se difundir, no entanto, é limitada devido à palmitoilação de Gα e à presença de uma porção isoprenóide que foi adicionada covalentemente aos terminais C de Gγ.

Como Gα também tem capacidade de hidrólise lenta de GTP→GDP, a forma inativa da subunidade α (Gα-GDP) é eventualmente regenerada, permitindo assim a reassociação com um dímero Gβγ para formar o "repouso" Proteína G, que pode se ligar novamente a um GPCR e aguardar a ativação. A taxa de hidrólise de GTP é muitas vezes acelerada devido às ações de outra família de proteínas moduladoras alostéricas chamadas reguladoras de sinalização de proteína G, ou proteínas RGS, que são um tipo de proteína ativadora de GTPase, ou GAP. De fato, muitas das proteínas efetoras primárias (por exemplo, adenilato ciclases) que se tornam ativadas/inativadas após interação com Gα-GTP também possuem atividade GAP. Assim, mesmo neste estágio inicial do processo, a sinalização iniciada por GPCR tem a capacidade de auto-terminação.

Fala cruzada

Interações previstas a jusante entre sinalização de integrina e GPCRs. Integrinas são mostradas elevando Ca²⁺ e FAK fosforilizante, que está enfraquecendo a sinalização GPCR.

Sinais downstream de GPCRs mostraram possivelmente interagir com sinais de integrina, como FAK. A sinalização da integrina irá fosforilar FAK, o que pode então diminuir a atividade GPCR G_αs.

Sinalização

Mecanismo do receptor da proteína G

Se um receptor em um estado ativo encontra uma proteína G, ele pode ativá-la. Algumas evidências sugerem que os receptores e as proteínas G são, na verdade, pré-acoplados. Por exemplo, a ligação de proteínas G a receptores afeta a afinidade do receptor por ligantes. As proteínas G ativadas estão ligadas ao GTP.

Mais transdução de sinal depende do tipo de proteína G. A enzima adenilato ciclase é um exemplo de proteína celular que pode ser regulada por uma proteína G, neste caso a proteína G Gs. A atividade da adenilato ciclase é ativada quando se liga a uma subunidade da proteína G ativada. A ativação da adenilato ciclase termina quando a proteína G retorna ao estado ligado ao GDP.

As adenilatos ciclases (das quais 9 formas ligadas à membrana e uma citosólica são conhecidas em humanos) também podem ser ativadas ou inibidas de outras maneiras (por exemplo, ligação Ca2+/calmodulina), que podem modificar a atividade dessas enzimas em um aditivo ou forma sinérgica junto com as proteínas G.

As vias de sinalização ativadas por meio de um GPCR são limitadas pela sequência primária e pela estrutura terciária do próprio GPCR, mas, em última análise, determinadas pela conformação específica estabilizada por um ligante específico, bem como pela disponibilidade de moléculas transdutoras. Atualmente, considera-se que os GPCRs utilizam dois tipos principais de transdutores: proteínas G e β-arrestinas. Como os β-arr's têm alta afinidade apenas com a forma fosforilada da maioria dos GPCRs (veja acima ou abaixo), a maioria da sinalização depende, em última análise, da ativação da proteína G. No entanto, a possibilidade de interação permite que ocorra sinalização independente da proteína G.

Sinalização dependente da proteína G

Existem três principais vias de sinalização mediadas por proteínas G, mediadas por quatro subclasses de proteínas G distintas entre si por homologia de sequência (Gαs, Gαi/o, Gαq/11 e Gα12/13). Cada subclasse de proteína G consiste em múltiplas proteínas, cada uma produto de múltiplos genes ou variações de splicing que podem imbuí-las com diferenças que variam de sutis a distintas em relação às propriedades de sinalização, mas em geral elas aparecem razoavelmente agrupadas em quatro classes. Como as propriedades de transdução de sinal das várias combinações βγ possíveis não parecem diferir radicalmente umas das outras, essas classes são definidas de acordo com a isoforma de sua subunidade α.

Embora a maioria dos GPCRs seja capaz de ativar mais de um subtipo Gα, eles também mostram preferência por um subtipo em detrimento de outro. Quando o subtipo ativado depende do ligante que está ligado ao GPCR, isso é chamado de seletividade funcional (também conhecido como tráfico dirigido por agonista ou agonismo específico da conformação). No entanto, a ligação de qualquer agonista específico também pode iniciar a ativação de várias proteínas G diferentes, pois pode ser capaz de estabilizar mais de uma conformação do domínio GEF do GPCR, mesmo ao longo de uma única interação. Além disso, uma conformação que preferencialmente ativa uma isoforma de Gα pode ativar outra se a preferencial estiver menos disponível. Além disso, as vias de feedback podem resultar em modificações do receptor (por exemplo, fosforilação) que alteram a preferência da proteína G. Independentemente dessas várias nuances, o parceiro de acoplamento preferencial do GPCR é geralmente definido de acordo com a proteína G mais obviamente ativada pelo ligante endógeno na maioria das condições fisiológicas ou experimentais.

Sinalização Gα

1. O efetor de ambos os G_α e G_αi/o Pathways é o monofosfato cíclico-adenosina (cAMP) gerando enzima adenilato ciclase, ou AC. Embora existam dez diferentes produtos do gene AC em mamíferos, cada um com diferenças sutis na distribuição ou função do tecido, todos catalisam a conversão de trifosfato de adenosina citosólica (ATP) para cAMP, e todos são estimulados diretamente por G-proteínas do G_α classe. Em contraste, no entanto, interação com subunidades Gα do G_αi/o tipo inibe AC da geração cAMP. Assim, um GPCR acoplado a G_α neutraliza as ações de um GPCR acoplado a G_αi/oe vice-versa. O nível de cAMP citosólico pode então determinar a atividade de vários canais iônicos, bem como membros da família de quinase A (PKA) ser / proteína específica. Assim, cAMP é considerado um segundo mensageiro e PKA um efetor secundário.
2. O efeito do G_αq/11 pathway é fosfolipase C-β (PLCβ), que catalisa a clivagem do fosfatidylinositol de membrana 4,5-bisfosfato (PIP2) no segundo mensageiros inositol (1,4,5) trisfosfato (IP3) e diacylglycerol (DAG). O IP3 atua nos receptores IP3 encontrados na membrana do retículo endoplasmático (ER) para elicitar a liberação de Ca2+ da ER, enquanto o DAG difunde ao longo da membrana plasmática onde pode ativar qualquer forma localizada de membrana de um segundo ser/thr kinase chamada proteína quinase C (PKC). Uma vez que muitas isoformas de PKC também são ativadas por aumentos no Ca intracelular²⁺, ambas as vias também podem convergir uns aos outros para sinalizar através do mesmo efetor secundário. Elevado intracelular Ca²⁺ também liga e alostericamente ativa as proteínas chamadas calmadulinas, que por sua vez tosómica pequena GTPase, Rho. Uma vez ligado ao GTP, Rho pode então continuar a ativar várias proteínas responsáveis pela regulação do cytoskeleton, como Rho-kinase (ROCK). A maioria de GPCRs que casal de G_α12/13 também par a outras subclasses, muitas vezes G_αq/11.

Sinalização Gβγ

As descrições acima ignoram os efeitos da sinalização de Gβγ, que também pode ser importante, em particular no caso de GPCRs acoplados a G_αi/o ativados. Os efetores primários de Gβγ são vários canais iônicos, como canais de K+ retificadores internos regulados pela proteína G (GIRKs), canais de Ca2+ controlados por voltagem tipo P/Q e N, bem como algumas isoformas de AC e PLC, juntamente com com algumas isoformas de fosfoinositídeo-3-quinase (PI3K).

Sinalização independente da proteína G

Embora classicamente se pense que funcionam apenas em conjunto, os GPCRs podem sinalizar através de mecanismos independentes da proteína G, e as proteínas G heterotriméricas podem desempenhar papéis funcionais independentes dos GPCRs. Os GPCRs podem sinalizar independentemente através de muitas proteínas já mencionadas por seus papéis na sinalização dependente da proteína G, como β-arrs, GRKs e Srcs. Tal sinalização demonstrou ser fisiologicamente relevante, por exemplo, a sinalização de β-arrestina mediada pelo receptor de quimiocina CXCR3 foi necessária para a quimiotaxia de eficácia total de células T ativadas. Além disso, outras proteínas de andaime envolvidas na localização subcelular de GPCRs (por exemplo, proteínas contendo domínio PDZ) também podem atuar como transdutores de sinal. Na maioria das vezes, o efetor é um membro da família MAPK.

Exemplos

No final da década de 1990, começaram a se acumular evidências sugerindo que alguns GPCRs são capazes de sinalizar sem proteínas G. A proteína quinase ativada por mitógeno ERK2, um mediador chave de transdução de sinal a jusante da ativação do receptor em muitas vias, demonstrou ser ativada em resposta à ativação do receptor mediada por cAMP no fungo D. discoideum, apesar da ausência da proteína G associada subunidades α e β.

Em células de mamíferos, o muito estudado β₂-adrenoceptor demonstrou ativar a via ERK2 após o desacoplamento mediado por arrestina da sinalização mediada por proteína G. Portanto, parece provável que alguns mecanismos anteriormente considerados puramente relacionados à dessensibilização do receptor sejam, na verdade, exemplos de receptores trocando sua via de sinalização, em vez de simplesmente serem desligados.

Nas células renais, foi demonstrado que o receptor de bradicinina B2 interage diretamente com uma proteína tirosina fosfatase. A presença de uma sequência ITIM fosforilada em tirosina (motivo inibidor baseado em tirosina) no receptor B2 é necessária para mediar essa interação e subsequentemente o efeito antiproliferativo da bradicinina.

Sinalização independente de GPCR por proteínas G heterotriméricas

Embora seja uma área de pesquisa relativamente imatura, parece que as proteínas G heterotriméricas também podem participar da sinalização não-GPCR. Há evidências de papéis como transdutores de sinal em quase todos os outros tipos de sinalização mediada por receptores, incluindo integrinas, receptores de tirosina quinases (RTKs), receptores de citocinas (JAK/STATs), bem como a modulação de vários outros "acessórios". 34; proteínas tais como GEFs, inibidores de dissociação de nucleotídeos de guanina (GDIs) e fosfatases de proteínas. Pode até haver proteínas específicas dessas classes cuja função primária é fazer parte de vias independentes de GPCR, denominadas ativadores da sinalização da proteína G (AGS). Tanto a onipresença dessas interações quanto a importância das subunidades Gα vs. Gβγ para esses processos ainda não estão claras.

Detalhes das vias cAMP e PIP2

Efeitos de ativação de cAMP na proteína quinase A

O efeito de Rs e Gs na via de sinal cAMP

O efeito de Ri e Gi no caminho do sinal cAMP

Existem duas vias principais de transdução de sinal envolvendo os receptores ligados à proteína G: a via de sinal de cAMP e a via de sinal de fosfatidilinositol.

Via do sinal CAMP

A transdução do sinal cAMP contém 5 caracteres principais: receptor de hormônio estimulador (Rs) ou receptor de hormônio inibitório (Ri); proteína G reguladora estimuladora (Gs) ou proteína G reguladora inibitória (Gi); adenilil ciclase; proteína quinase A (PKA); e cAMP fosfodiesterase.

Receptor de hormônio estimulante (Rs) é um receptor que pode se ligar a moléculas sinalizadoras estimulantes, enquanto o receptor de hormônio inibitório (Ri) é um receptor que pode se ligar a moléculas sinalizadoras inibitórias.

A proteína G reguladora estimuladora é uma proteína G ligada ao receptor de hormônio estimulador (Rs), e sua subunidade α após a ativação pode estimular a atividade de uma enzima ou outro metabolismo intracelular. Pelo contrário, a proteína G reguladora inibitória está ligada a um receptor de hormônio inibitório, e sua subunidade α após ativação pode inibir a atividade de uma enzima ou outro metabolismo intracelular.

Adenilil ciclase é uma glicoproteína transmembranar 12 que catalisa a conversão de ATP em cAMP com a ajuda do cofator Mg²⁺ ou Mn²⁺. O cAMP produzido é um segundo mensageiro no metabolismo celular e é um ativador alostérico da proteína quinase A.

A proteína quinase A é uma enzima importante no metabolismo celular devido à sua capacidade de regular o metabolismo celular por meio da fosforilação de enzimas específicas comprometidas na via metabólica. Também pode regular a expressão gênica específica, a secreção celular e a permeabilidade da membrana. A enzima proteica contém duas subunidades catalíticas e duas subunidades reguladoras. Quando não há cAMP, o complexo é inativo. Quando o cAMP se liga às subunidades regulatórias, sua conformação é alterada, causando a dissociação das subunidades regulatórias, o que ativa a proteína quinase A e permite efeitos biológicos posteriores.

Esses sinais podem então ser interrompidos pela cAMP fosfodiesterase, que é uma enzima que degrada o cAMP em 5'-AMP e inativa a proteína quinase A.

Via de sinalização do fosfatidilinositol

Na via de sinalização do fosfatidilinositol, a molécula sinalizadora extracelular liga-se ao receptor da proteína G (G_q) na superfície celular e ativa a fosfolipase C, localizada na membrana plasmática. A lipase hidrolisa o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O IP3 se liga ao receptor IP3 na membrana do retículo endoplasmático liso e mitocôndrias para abrir canais de Ca²⁺. O DAG ajuda a ativar a proteína quinase C (PKC), que fosforila muitas outras proteínas, alterando suas atividades catalíticas, levando a respostas celulares.

Os efeitos de Ca²⁺ também são notáveis: ele coopera com DAG na ativação de PKC e pode ativar a via CaM quinase, na qual a proteína calmodulina (CaM) modulada por cálcio se liga a Ca ²⁺, sofre uma alteração na conformação e ativa a CaM quinase II, que tem a capacidade única de aumentar sua afinidade de ligação com a CaM por autofosforilação, tornando a CaM indisponível para a ativação de outras enzimas. A quinase então fosforila as enzimas-alvo, regulando suas atividades. As duas vias de sinalização são conectadas por Ca²⁺-CaM, que também é uma subunidade reguladora da adenilil ciclase e da fosfodiesterase na via de sinalização do cAMP.

Regulação do receptor

Os GPCRs tornam-se dessensibilizados quando expostos ao seu ligante por um longo período de tempo. Existem duas formas reconhecidas de dessensibilização: 1) dessensibilização homóloga, na qual o GPCR ativado é regulado negativamente; e 2) dessensibilização heteróloga, em que o GPCR ativado causa a regulação negativa de um GPCR diferente. A principal reação dessa regulação negativa é a fosforilação do domínio do receptor intracelular (ou citoplasmático) pelas proteínas quinases.

Fosforilação por proteínas quinases dependentes de cAMP

As proteínas quinases dependentes de AMP cíclico (proteína quinase A) são ativadas pela cadeia de sinal proveniente da proteína G (que foi ativada pelo receptor) via adenilato ciclase e AMP cíclico (cAMP). Em um mecanismo de feedback, essas quinases ativadas fosforilam o receptor. Quanto mais tempo o receptor permanece ativo, mais quinases são ativadas e mais receptores são fosforilados. Nos adrenoceptores β2, essa fosforilação resulta na troca do acoplamento da classe G_s da proteína G para a classe Gi. A fosforilação mediada por PKA dependente de cAMP pode causar dessensibilização heteróloga em receptores diferentes daqueles ativados.

Fosforilação por GRKs

Os receptores quinases acoplados à proteína G (GRKs) são proteínas quinases que fosforilam apenas GPCRs ativos. As cinases receptoras acopladas à proteína G (GRKs) são os principais moduladores da sinalização do receptor acoplado à proteína G (GPCR). Eles constituem uma família de sete proteínas cinases serina-treonina de mamíferos que fosforilam o receptor ligado ao agonista. A fosforilação do receptor mediada por GRKs inicia rapidamente um comprometimento profundo da sinalização e dessensibilização do receptor. A atividade dos GRKs e do direcionamento subcelular é estritamente regulada pela interação com os domínios do receptor, subunidades da proteína G, lipídios, proteínas de ancoragem e proteínas sensíveis ao cálcio.

A fosforilação do receptor pode ter duas consequências:

1. Transição: O receptor é, juntamente com a parte da membrana embutida, trazido para dentro da célula, onde é desfosforilado dentro do ambiente vesicular ácido e, em seguida, trazido de volta. Este mecanismo é usado para regular a exposição a longo prazo, por exemplo, a um hormônio, permitindo a ressensibilidade a seguir a dessensibilização. Alternativamente, o receptor pode sofrer degradação lysozomal, ou permanecer internado, onde se pensa participar da iniciação de eventos de sinalização, cuja natureza depende da localização subcelular da vesícula internada.
2. Ligação de prisão: O receptor fosforilado pode ser ligado a detenção moléculas que o impedem de ligar (e ativar) Proteínas G, com efeito, desligando-a por um curto período de tempo. Este mecanismo é usado, por exemplo, com rhodopsina em células de retina para compensar a exposição à luz brilhante. Em muitos casos, a ligação da prisão ao receptor é um pré-requisito para translocação. Por exemplo, a beta-arrestina ligada a β₂-adrenoreceptores atua como um adaptador para vinculação com clatrina, e com a subunidade beta de AP2 (moléculas adaptadoras de catrina); assim, a prisão aqui atua como um andaime reunindo os componentes necessários para a endocitose mediada por clatrina de β₂-Renoreceptores.

Mecanismos de terminação do sinal GPCR

Como mencionado acima, as proteínas G podem terminar sua própria ativação devido à sua capacidade intrínseca de hidrólise de GTP→GDP. No entanto, essa reação ocorre em uma taxa lenta (≈,02 vezes/seg) e, portanto, levaria cerca de 50 segundos para qualquer proteína G ser desativada se outros fatores não entrassem em ação. De fato, existem cerca de 30 isoformas de proteínas RGS que, quando ligadas a Gα através de seu domínio GAP, aceleram a taxa de hidrólise para ≈30 vezes/seg. Esse aumento de 1.500 vezes na taxa permite que a célula responda a sinais externos com alta velocidade, bem como resolução espacial devido à quantidade limitada de segundo mensageiro que pode ser gerado e à distância limitada que uma proteína G pode difundir em 0,03 segundos. Na maioria das vezes, as proteínas RGS são promíscuas em sua capacidade de desativar as proteínas G, enquanto qual RGS está envolvida em uma determinada via de sinalização parece mais determinada pelo tecido e GPCR envolvidos do que qualquer outra coisa. Além disso, as proteínas RGS têm a função adicional de aumentar a taxa de troca GTP-GDP nos GPCRs, (ou seja, como uma espécie de co-GEF), contribuindo ainda mais para a resolução temporal da sinalização GPCR.

Além disso, o próprio GPCR pode ser dessensibilizado. Isso pode ocorrer como:

1. um resultado direto da ocupação do ligante, em que a mudança na conformação permite o recrutamento de Kinases Reguladores GPCR (GRKs), que passam a fosforilar vários resíduos de serina/treonina de IL-3 e a cauda C-terminal. Após a fosforilação GRK, a afinidade do GPCR para a β-arrestina (β-arrestina-1/2 na maioria dos tecidos) é aumentada, em que ponto a β-arrestina pode ligar e agir para dificultar esteticamente o acoplamento da proteína G, bem como iniciar o processo de internalização do receptor através da endocitose mediada da clatrina. Porque apenas o receptor liganded é dessensibilizado por este mecanismo, é chamado de dessensibilização homologous
2. A afinidade para β-arrestina pode ser aumentada em uma ocupação ligante e GRK-independente maneira através da fosforilação de diferentes locais ser/thr (mas também de IL-3 e a cauda C-terminal) por PKC e PKA. Estas fosforilações são muitas vezes suficientes para prejudicar o acoplamento de proteína G por conta própria também.
3. PKC/PKA pode, em vez disso, fosforilato GRKs, que também pode levar à fosforilação GPCR e à ligação β-arrestina de forma independente de ocupação. Estes dois últimos mecanismos permitem a dessensibilização de um GPCR devido às atividades de outros, ou dessensibilização heterologous. Os GRKs também podem ter domínios GAP e assim também podem contribuir para a inativação através de mecanismos não-kinase. Uma combinação desses mecanismos também pode ocorrer.

Uma vez que a β-arrestina é ligada a um GPCR, ela sofre uma mudança conformacional que permite que ela sirva como uma proteína de andaime para um complexo adaptador denominado AP-2, que por sua vez recruta outra proteína chamada clatrina. Se receptores suficientes na área local recrutarem clatrina dessa maneira, eles se agregam e a membrana brota internamente como resultado de interações entre as moléculas de clatrina, em um processo chamado opsonização. Uma vez que o poço foi retirado da membrana plasmática devido às ações de duas outras proteínas chamadas anfifisina e dinamina, ele agora é uma vesícula endocítica. Nesse ponto, as moléculas adaptadoras e a clatrina se dissociaram e o receptor é trafegado de volta à membrana plasmática ou direcionado aos lisossomos para degradação.

Em qualquer ponto desse processo, as β-arrestinas também podem recrutar outras proteínas - como a tirosina quinase não receptora (nRTK), c-SRC - que pode ativar ERK1/2 ou outra proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) por meio, por exemplo, da fosforilação da pequena GTPase, Ras, ou recrutar as proteínas da cascata ERK diretamente (ou seja, Raf-1, MEK, ERK-1/2) no ponto em que a sinalização é iniciada devido à sua proximidade um do outro. Outro alvo do c-SRC são as moléculas de dinamina envolvidas na endocitose. As dinaminas polimerizam ao redor do gargalo de uma vesícula de entrada, e sua fosforilação por c-SRC fornece a energia necessária para a mudança conformacional, permitindo o "pinçamento" da membrana.

Regulação celular GPCR

A dessensibilização do receptor é mediada por uma combinação de fosforilação, ligação de β-arr e endocitose conforme descrito acima. A regulação negativa ocorre quando o receptor endocitado é incorporado em um endossomo que é traficado para se fundir com uma organela chamada lisossomo. Como as membranas lisossômicas são ricas em bombas de prótons, seus interiores têm pH baixo (≈4,8 vs. pH≈7,2 citosol), que age desnaturando os GPCRs. Além disso, os lisossomos contêm muitas enzimas degradativas, incluindo proteases, que podem funcionar apenas em pH tão baixo e, portanto, as ligações peptídicas que unem os resíduos do GPCR podem ser clivadas. Se um determinado receptor é ou não trafegado para um lisossomo, retido em endossomos ou trafegado de volta para a membrana plasmática depende de uma variedade de fatores, incluindo o tipo de receptor e a magnitude do sinal. A regulação de GPCR é adicionalmente mediada por fatores de transcrição gênica. Esses fatores podem aumentar ou diminuir a transcrição do gene e, assim, aumentar ou diminuir a geração de novos receptores (regulação positiva ou negativa) que viajam para a membrana celular.

Oligomerização do receptor

A oligomerização do receptor acoplado à proteína G é um fenômeno generalizado. Um dos exemplos mais bem estudados é o receptor GABAB metabotrópico. Este chamado receptor constitutivo é formado pela heterodimerização das subunidades GABABR1 e GABABR2. A expressão do GABA_BR1 sem o GABA_BR2 em sistemas heterólogos leva à retenção da subunidade no retículo endoplasmático. A expressão da subunidade GABA_BR2 sozinha, por sua vez, leva à expressão superficial da subunidade, embora sem atividade funcional (ou seja, o receptor não se liga ao agonista e não pode iniciar uma resposta após a exposição ao agonista). A expressão das duas subunidades juntas leva à expressão do receptor funcional na membrana plasmática. Foi demonstrado que a ligação do GABA_BR2 ao GABA_BR1 causa o mascaramento de um sinal de retenção de receptores funcionais.

Origem e diversificação da superfamília

A transdução de sinal mediada pela superfamília dos GPCRs remonta à origem da multicelularidade. GPCRs semelhantes a mamíferos são encontrados em fungos e foram classificados de acordo com o sistema de classificação GRAFS baseado em impressões digitais de GPCR. A identificação dos membros da superfamília no domínio eucariótico e a comparação dos motivos específicos da família mostraram que a superfamília de GPCRs tem uma origem comum. Motivos característicos indicam que três das cinco famílias GRAFS, Rhodopsin, Adhesion e Frizzled, evoluíram dos receptores Dictyostelium discoideum cAMP antes da divisão de opisthokonts. Mais tarde, a família Secretina evoluiu a partir da família de receptores GPCR Adesão antes da divisão dos nematóides. GPCRs de insetos parecem estar em seu próprio grupo e Taste2 é identificado como descendente de Rhodopsin. Observe que a divisão Secretina/Adesão é baseada na função presumida e não na assinatura, pois a clássica Classe B (7tm_2, Pfam PF00002) é usada para identificar ambas nos estudos.