Proteólise
Proteólise é a quebra de proteínas em polipeptídeos ou aminoácidos menores. Não catalisada, a hidrólise das ligações peptídicas é extremamente lenta, levando centenas de anos. A proteólise é tipicamente catalisada por enzimas celulares chamadas proteases, mas também pode ocorrer por digestão intramolecular.
A proteólise em organismos serve a muitos propósitos; por exemplo, as enzimas digestivas quebram as proteínas dos alimentos para fornecer aminoácidos ao organismo, enquanto o processamento proteolítico de uma cadeia polipeptídica após sua síntese pode ser necessário para a produção de uma proteína ativa. Também é importante na regulação de alguns processos fisiológicos e celulares, incluindo a apoptose, bem como na prevenção do acúmulo de proteínas indesejadas ou mal dobradas nas células. Consequentemente, anormalidades na regulação da proteólise podem causar doenças.
A proteólise também pode ser usada como uma ferramenta analítica para estudar proteínas em laboratório, e também pode ser usada na indústria, por exemplo, no processamento de alimentos e na remoção de manchas.
Funções biológicas
Processamento proteolítico pós-traducional
A proteólise limitada de um polipeptídeo durante ou após a tradução na síntese de proteínas geralmente ocorre para muitas proteínas. Isso pode envolver a remoção da metionina N-terminal, peptídeo sinal e/ou a conversão de uma proteína inativa ou não funcional em uma proteína ativa. O precursor da forma funcional final da proteína é denominado pró-proteína, e essas pró-proteínas podem ser sintetizadas primeiro como pré-pró-proteína. Por exemplo, a albumina é primeiro sintetizada como pré-pró-albumina e contém um peptídeo sinal não clivado. Isso forma a pró-albumina depois que o peptídeo de sinal é clivado, e um processamento adicional para remover o pró-peptídeo de 6 resíduos N-terminal produz a forma madura da proteína.
Remoção de metionina N-terminal
A metionina iniciadora (e, em procariontes, fMet) pode ser removida durante a tradução da proteína nascente. Para E. coli, fMet é eficientemente removido se o segundo resíduo for pequeno e não carregado, mas não se o segundo resíduo for volumoso e carregado. Tanto em procariotas como em eucariotas, o resíduo N-terminal exposto pode determinar a meia-vida da proteína de acordo com a regra N-end.
Remoção da sequência de sinal
As proteínas que devem ser direcionadas para uma organela específica ou para secreção têm um peptídeo de sinal N-terminal que direciona a proteína ao seu destino final. Este peptídeo sinal é removido por proteólise após seu transporte através de uma membrana.
Clivagem de poliproteínas
Algumas proteínas e a maioria dos hormônios polipeptídicos eucarióticos são sintetizados como um grande polipeptídeo precursor conhecido como poliproteína que requer clivagem proteolítica em cadeias polipeptídicas menores individuais. A poliproteína pró-opiomelanocortina (POMC) contém muitos hormônios polipeptídicos. O padrão de clivagem do POMC, no entanto, pode variar entre diferentes tecidos, produzindo diferentes conjuntos de hormônios polipeptídicos da mesma poliproteína.
Muitos vírus também produzem suas proteínas inicialmente como uma única cadeia polipeptídica que foi traduzida de um mRNA policistrônico. Este polipeptídeo é subsequentemente clivado em cadeias polipeptídicas individuais. Nomes comuns para a poliproteína incluem gag (antígeno específico do grupo) em retrovírus e ORF1ab em Nidovirales. Este último nome refere-se ao fato de que uma sequência escorregadia no mRNA que codifica o polipeptídeo causa frameshifting ribossomal, levando a dois comprimentos diferentes de cadeias peptídicas (a e ab) em uma proporção aproximadamente fixa.
Clivagem de proteínas precursoras
Muitas proteínas e hormônios são sintetizados na forma de seus precursores - zimogênios, pró-enzimas e pré-hormônios. Essas proteínas são clivadas para formar suas estruturas ativas finais. A insulina, por exemplo, é sintetizada como pré-pró-insulina, que produz pró-insulina após a clivagem do peptídeo sinal. A pró-insulina é então clivada em duas posições para produzir duas cadeias polipeptídicas ligadas por duas pontes dissulfeto. A remoção de dois resíduos C-terminais da cadeia B produz a insulina madura. O dobramento da proteína ocorre na forma de pró-insulina de cadeia simples, que facilita a formação das ligações dissulfeto interpeptídicas finais e a ligação dissulfeto intrapeptídica final, encontradas na estrutura nativa da insulina.
As proteases, em particular, são sintetizadas na forma inativa para que possam ser armazenadas com segurança nas células e prontas para liberação em quantidade suficiente quando necessário. Isso é para garantir que a protease seja ativada apenas no local ou contexto correto, pois a ativação inadequada dessas proteases pode ser muito destrutiva para um organismo. A proteólise do zimogênio produz uma proteína ativa; por exemplo, quando o tripsinogênio é clivado para formar tripsina, ocorre um leve rearranjo da estrutura da proteína que completa o sítio ativo da protease, ativando assim a proteína.
A proteólise pode, portanto, ser um método de regulação de processos biológicos, transformando proteínas inativas em ativas. Um bom exemplo é a cascata de coagulação do sangue em que um evento inicial desencadeia uma cascata de ativação proteolítica sequencial de muitas proteases específicas, resultando na coagulação do sangue. O sistema complemento da resposta imune também envolve uma complexa ativação proteolítica sequencial e interação que resulta em um ataque a patógenos invasores.
Degradação de proteínas
A degradação de proteínas pode ocorrer intracelularmente ou extracelularmente. Na digestão dos alimentos, as enzimas digestivas podem ser liberadas no ambiente para a digestão extracelular, por meio da qual a clivagem proteolítica quebra as proteínas em peptídeos e aminoácidos menores para que possam ser absorvidos e usados. Em animais, o alimento pode ser processado extracelularmente em órgãos especializados ou intestinos, mas em muitas bactérias o alimento pode ser internalizado por fagocitose. A degradação microbiana de proteínas no ambiente pode ser regulada pela disponibilidade de nutrientes. Por exemplo, a limitação de elementos principais em proteínas (carbono, nitrogênio e enxofre) induz atividade proteolítica no fungo Neurospora crassa, bem como em comunidades de organismos do solo.
As proteínas nas células são quebradas em aminoácidos. Essa degradação intracelular de proteínas tem múltiplas funções: remove proteínas danificadas e anormais e evita seu acúmulo. Também serve para regular os processos celulares removendo enzimas e proteínas reguladoras que não são mais necessárias. Os aminoácidos podem então ser reutilizados para a síntese de proteínas.
Lisossoma e proteassoma
A degradação intracelular da proteína pode ser alcançada de duas maneiras - proteólise no lisossomo ou um processo dependente de ubiquitina que direciona proteínas indesejadas para o proteassoma. A via autofagia-lisossomal é normalmente um processo não seletivo, mas pode se tornar seletiva após a inanição, em que as proteínas com sequência peptídica KFERQ ou similar são quebradas seletivamente. O lisossomo contém um grande número de proteases, como as catepsinas.
O processo mediado pela ubiquitina é seletivo. Proteínas marcadas para degradação são ligadas covalentemente à ubiquitina. Muitas moléculas de ubiquitina podem estar ligadas em tandem a uma proteína destinada à degradação. A proteína poliubiquinada é direcionada a um complexo de protease dependente de ATP, o proteassoma. A ubiquitina é liberada e reutilizada, enquanto a proteína alvo é degradada.
Taxa de degradação de proteínas intracelulares
Proteínas diferentes são degradadas em taxas diferentes. Proteínas anormais são rapidamente degradadas, enquanto a taxa de degradação de proteínas normais pode variar amplamente, dependendo de suas funções. Enzimas em importantes pontos de controle metabólico podem ser degradadas muito mais rapidamente do que aquelas enzimas cuja atividade é amplamente constante sob todas as condições fisiológicas. Uma das proteínas degradadas mais rapidamente é a ornitina descarboxilase, que tem uma meia-vida de 11 minutos. Em contraste, outras proteínas como a actina e a miosina têm uma meia-vida de um mês ou mais, enquanto, em essência, a hemoglobina dura toda a vida de um eritrócito.
A regra N-end pode determinar parcialmente a meia-vida de uma proteína, e proteínas com segmentos ricos em prolina, ácido glutâmico, serina e treonina (as chamadas proteínas PEST) têm meia-vida curta. Outros fatores suspeitos de afetar a taxa de degradação incluem a desaminação da taxa de glutamina e asparagina e a oxidação de cisteína, histidina e metionina, a ausência de ligantes estabilizadores, a presença de carboidratos ligados ou grupos fosfato, a presença de um grupo α-amino livre, a carga negativa da proteína e a flexibilidade e estabilidade da proteína. Proteínas com maiores graus de desordem intrínseca também tendem a ter meia-vida celular curta, com segmentos desordenados tendo sido propostos para facilitar a iniciação eficiente da degradação pelo proteassoma.
A taxa de proteólise também pode depender do estado fisiológico do organismo, como seu estado hormonal, bem como o estado nutricional. Em tempo de fome, a taxa de degradação de proteínas aumenta.
Digestão
Na digestão humana, as proteínas dos alimentos são quebradas em cadeias peptídicas menores por enzimas digestivas, como pepsina, tripsina, quimotripsina e elastase, e em aminoácidos por várias enzimas, como carboxipeptidase, aminopeptidase e dipeptidase. É necessário quebrar as proteínas em pequenos peptídeos (tripeptídeos e dipeptídeos) e aminoácidos para que possam ser absorvidos pelos intestinos, e os tripeptídeos e dipeptídeos absorvidos também são quebrados em aminoácidos intracelularmente antes de entrarem na corrente sanguínea. Diferentes enzimas têm diferentes especificidades para seus substratos; a tripsina, por exemplo, cliva a ligação peptídica após um resíduo carregado positivamente (arginina e lisina); a quimotripsina cliva a ligação após um resíduo aromático (fenilalanina, tirosina e triptofano); a elastase cliva a ligação após um pequeno resíduo não polar, como alanina ou glicina.
A fim de prevenir a ativação inadequada ou prematura das enzimas digestivas (elas podem, por exemplo, desencadear a autodigestão pancreática causando pancreatite), essas enzimas são secretadas como zimogênio inativo. O precursor da pepsina, o pepsinogênio, é secretado pelo estômago e é ativado apenas no ambiente ácido encontrado no estômago. O pâncreas secreta os precursores de várias proteases, como tripsina e quimotripsina. O zimogênio da tripsina é o tripsinogênio, que é ativado por uma protease muito específica, a enteroquinase, secretada pela mucosa do duodeno. A tripsina, uma vez ativada, também pode clivar outros tripsinogênios, bem como os precursores de outras proteases, como a quimotripsina e a carboxipeptidase, para ativá-los.
Em bactérias, uma estratégia semelhante de empregar um zimogênio ou prezimógeno inativo é usada. A subtilisina, que é produzida pelo Bacillus subtilis, é produzida como pré-pró-subtilisina e é liberada somente se o peptídeo sinal for clivado e a ativação proteolítica autocatalítica tiver ocorrido.
Regulação celular
A proteólise também está envolvida na regulação de muitos processos celulares ativando ou desativando enzimas, fatores de transcrição e receptores, por exemplo, na biossíntese do colesterol ou na mediação da sinalização da trombina por meio de receptores ativados por protease.
Algumas enzimas em importantes pontos de controle metabólico, como a ornitina descarboxilase, são reguladas inteiramente por sua taxa de síntese e sua taxa de degradação. Outras proteínas rapidamente degradadas incluem os produtos proteicos de proto-oncogenes, que desempenham papéis centrais na regulação do crescimento celular.
Regulação do ciclo celular
As ciclinas são um grupo de proteínas que ativam quinases envolvidas na divisão celular. A degradação das ciclinas é a etapa chave que governa a saída da mitose e o progresso para o próximo ciclo celular. As ciclinas se acumulam no curso do ciclo celular e desaparecem abruptamente pouco antes da anáfase da mitose. As ciclinas são removidas através de uma via proteolítica mediada por ubiquitina.
Apoptose
As caspases são um importante grupo de proteases envolvidas na apoptose ou morte celular programada. Os precursores da caspase, procaspase, podem ser ativados por proteólise por meio de sua associação com um complexo proteico que forma o apoptossoma, ou pela granzima B, ou pelas vias dos receptores de morte.
Autoproteólise
A autoproteólise ocorre em algumas proteínas, em que a ligação peptídica é quebrada em uma reação intramolecular autocatalisada. Ao contrário dos zimogênios, essas proteínas autoproteolíticas participam de um "turnover único" reação e não catalisam outras reações pós-clivagem. Os exemplos incluem clivagem da ligação Asp-Pro em um subconjunto de domínios do tipo D (VWD) do fator de von Willebrand e domínio de autoprocessamento Neisseria meningitidis FrpC, clivagem da ligação Asn-Pro em Salmonella proteína FlhB, proteína Yersinia YscU, bem como clivagem da ligação Gly-Ser em um subconjunto de domínios de proteína de esperma de ouriço-do-mar, enteroquinase e agrina (SEA). Em alguns casos, a clivagem autoproteolítica é promovida pela tensão conformacional da ligação peptídica.
Proteólise e doenças
A atividade proteolítica anormal está associada a muitas doenças. Na pancreatite, o vazamento de proteases e sua ativação prematura no pâncreas resulta na autodigestão do pâncreas. Pessoas com diabetes mellitus podem ter atividade lisossômica aumentada e a degradação de algumas proteínas pode aumentar significativamente. Doenças inflamatórias crônicas, como a artrite reumatóide, podem envolver a liberação de enzimas lisossômicas no espaço extracelular que quebram os tecidos circundantes. A proteólise anormal pode resultar em muitas doenças neurológicas relacionadas à idade, como Alzheimer, devido à geração e remoção ineficaz de peptídeos que se agregam nas células.
As proteases podem ser reguladas por antiproteases ou inibidores de proteases, e o desequilíbrio entre proteases e antiproteases pode resultar em doenças, por exemplo, na destruição de tecidos pulmonares no enfisema causado pelo fumo do tabaco. Acredita-se que fumar aumente os neutrófilos e macrófagos no pulmão, que liberam uma quantidade excessiva de enzimas proteolíticas, como a elastase, de modo que não possam mais ser inibidas por serpinas, como a α1-antitripsina, resultando assim na quebra de tecidos conjuntivos no pulmão. Outras proteases e seus inibidores também podem estar envolvidos nesta doença, por exemplo, metaloproteinases de matriz (MMPs) e inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs).
Outras doenças ligadas à proteólise aberrante incluem distrofia muscular, doenças degenerativas da pele, doenças respiratórias e gastrointestinais e malignidade.
Processos não enzimáticos
Os esqueletos de proteínas são muito estáveis em água com pH neutro e temperatura ambiente, embora a taxa de hidrólise de diferentes ligações peptídicas possa variar. A meia-vida de uma ligação peptídica em condições normais pode variar de 7 anos a 350 anos, sendo ainda maior para peptídeos protegidos por terminal modificado ou dentro do interior da proteína. A taxa de hidrólise, no entanto, pode ser significativamente aumentada por extremos de pH e calor. A clivagem espontânea de proteínas também pode envolver catálise por zinco em serina e treonina.
Ácidos minerais fortes podem prontamente hidrolisar as ligações peptídicas em uma proteína (hidrólise ácida). A maneira padrão de hidrolisar uma proteína ou peptídeo em seus aminoácidos constituintes para análise é aquecê-lo a 105°C por cerca de 24 horas em ácido clorídrico 6M. No entanto, algumas proteínas são resistentes à hidrólise ácida. Um exemplo bem conhecido é a ribonuclease A, que pode ser purificada pelo tratamento de extratos brutos com ácido sulfúrico quente, de modo que outras proteínas sejam degradadas enquanto a ribonuclease A permanece intacta.
Certos produtos químicos causam proteólise somente após resíduos específicos, e estes podem ser usados para quebrar seletivamente uma proteína em polipeptídeos menores para análise laboratorial. Por exemplo, brometo de cianogênio cliva a ligação peptídica após uma metionina. Métodos semelhantes podem ser usados para clivar especificamente ligações peptídicas de triptofanil, aspartil, cisteinil e asparaginil. Ácidos como ácido trifluoroacético e ácido fórmico podem ser usados para clivagem.
Assim como outras biomoléculas, as proteínas também podem ser decompostas apenas por altas temperaturas. A 250 °C, a ligação peptídica pode ser facilmente hidrolisada, com sua meia-vida caindo para cerca de um minuto. A proteína também pode ser quebrada sem hidrólise através da pirólise; pequenos compostos heterocíclicos podem começar a se formar após a degradação. Acima de 500 °C, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos também podem se formar, o que é de interesse no estudo da geração de carcinógenos na fumaça do tabaco e no cozimento em fogo alto.
Aplicações de laboratório
A proteólise também é usada em aplicações de pesquisa e diagnóstico:
- Cleavage da proteína de fusão para que o parceiro de fusão e a etiqueta de proteína usados na expressão e purificação de proteínas possam ser removidos. As proteases utilizadas têm alto grau de especificidade, como trombina, enterokinase e protease TEV, de modo que apenas a sequência segmentada pode ser clivada.
- Inativação completa de atividade enzimática indesejável ou remoção de proteínas indesejadas. Por exemplo, a proteinase K, uma proteinase de amplo espectro estável na ureia e SDS, é frequentemente usada na preparação de ácidos nucleicos para remover contaminantes de nuclease indesejados que podem degradar o DNA ou o RNA.
- Inativação parcial ou alteração da funcionalidade, de proteína específica. Por exemplo, o tratamento da polimerase de DNA I com subtilisina produz o fragmento de Klenow, que mantém sua função polimerase, mas carece de atividade de 5 'exonuclease.
- Digestão de proteínas em solução para análise de proteoma por espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS). Isso também pode ser feito pela digestão in-gel de proteínas após a separação por eletroforese de gel para a identificação por espectrometria de massa.
- Análise da estabilidade do domínio dobrado sob uma ampla gama de condições.
- Aumentar a taxa de sucesso dos projectos de cristalização
- Produção de proteína digerida utilizada em meios de crescimento para bactérias de cultura e outros organismos, por exemplo, triptona em Broto de Lisogenia.
Enzimas de protease
As proteases podem ser classificadas de acordo com o grupo catalítico envolvido em seu sítio ativo.
- Proteína de cisteína
- Proteína de semeadura
- Proteína de Threonine
- Proteína aspática
- Proteína glutônica
- Metalização
- liase de peptídeo asparagine
Venenos
Alguns tipos de veneno, como os produzidos por cobras venenosas, também podem causar proteólise. Esses venenos são, na verdade, fluidos digestivos complexos que começam seu trabalho fora do corpo. Venenos proteolíticos causam uma ampla gama de efeitos tóxicos, incluindo efeitos que são:
- citotóxico (destroying de células)
- hemotóxico (destruição de sangue)
- myotoxic (destroying muscular)
- hemorrágica (abençoamento)