Primer (biologia molecular)
Um iniciador é um ácido nucléico de cadeia simples usado por todos os organismos vivos no início da síntese de DNA. As enzimas da DNA polimerase (responsáveis pela replicação do DNA) só são capazes de adicionar nucleotídeos à extremidade 3' de um ácido nucleico existente, exigindo que um iniciador seja ligado ao molde antes que a DNA polimerase possa iniciar uma fita complementar. A DNA polimerase adiciona nucleotídeos após a ligação ao primer de RNA e sintetiza toda a fita. Posteriormente, as fitas de RNA devem ser removidas com precisão e substituídas por nucleotídeos de DNA formando uma região de lacuna conhecida como entalhe que é preenchida por uma enzima chamada ligase. O processo de remoção do primer de RNA requer várias enzimas, como Fen1, Lig1 e outras que trabalham em coordenação com a DNA polimerase, para garantir a remoção dos nucleotídeos de RNA e a adição de nucleotídeos de DNA. Organismos vivos usam apenas primers de RNA, enquanto técnicas de laboratório em bioquímica e biologia molecular que requerem síntese de DNA in vitro (como sequenciamento de DNA e reação em cadeia da polimerase) geralmente usam primers de DNA, pois são mais estáveis à temperatura. Os primers podem ser projetados em laboratório para reações específicas, como a reação em cadeia da polimerase (PCR). Ao projetar primers de PCR, existem medidas específicas que devem ser levadas em consideração, como a temperatura de fusão dos primers e a temperatura de anelamento da própria reação. Além disso, a sequência de ligação do DNA do primer in vitro deve ser escolhida especificamente, o que é feito usando um método chamado ferramenta de busca de alinhamento local básico (BLAST) que escaneia o DNA e encontra regiões específicas e únicas para o primer se ligar.
Primeiros de RNA in vivo
Os primers de RNA são usados por organismos vivos no início da síntese de uma fita de DNA. Uma classe de enzimas chamadas primases adiciona um primer de RNA complementar ao modelo de leitura de novo nas fitas líder e atrasada. A partir do 3'-OH livre do iniciador, conhecido como terminal do iniciador, uma DNA polimerase pode estender uma fita recém-sintetizada. A fita líder na replicação do DNA é sintetizada em uma peça contínua movendo-se com a forquilha de replicação, exigindo apenas um iniciador de RNA inicial para iniciar a síntese. Na fita retardada, o DNA molde corre na direção 5'→3'. Como a DNA polimerase não pode adicionar bases na direção 3'→5' complementar à fita molde, o DNA é sintetizado "para trás" em fragmentos curtos que se afastam da forquilha de replicação, conhecidos como fragmentos de Okazaki. Ao contrário da cadeia líder, este método resulta no início e paragem repetidos da síntese de ADN, exigindo múltiplos iniciadores de ARN. Ao longo do molde de DNA, a primase intercala primers de RNA que a DNA polimerase usa para sintetizar DNA na direção 5'→3'.
Outro exemplo de primers usados para permitir a síntese de DNA é a transcrição reversa. A transcriptase reversa é uma enzima que usa uma fita molde de RNA para sintetizar uma fita complementar de DNA. O componente DNA polimerase da transcriptase reversa requer um 3' final para iniciar a síntese.
Remoção do iniciador
Após a inserção dos fragmentos de Okazaki, os primers de RNA são removidos (o mecanismo de remoção difere entre procariotos e eucariotos) e substituídos por novos desoxirribonucleotídeos que preenchem as lacunas onde o primer de RNA estava presente. A DNA ligase então une as fitas fragmentadas, completando a síntese da fita retardada.
Em procariontes, a DNA polimerase I sintetiza o fragmento de Okazaki até atingir o primer de RNA anterior. Em seguida, a enzima age simultaneamente como uma exonuclease 5'→3', removendo ribonucleotídeos primer na frente e adicionando desoxirribonucleotídeos atrás. Ambas as atividades de polimerização e excisão do primer de RNA ocorrem na direção 5'→3', e a polimerase I pode realizar essas atividades simultaneamente; isso é conhecido como “Nick Translation”. A tradução de Nick refere-se à atividade sincronizada da polimerase I na remoção do iniciador de RNA e na adição de desoxirribonucleotídeos. Posteriormente, forma-se um espaço entre as fitas chamado entalhe, que é selado por meio de uma ligase de DNA.
Em eucariotos, a remoção de iniciadores de RNA na fita retardada é essencial para a conclusão da replicação. Assim, à medida que a fita retardada é sintetizada pela DNA polimerase δ na direção 5'→3', são formados fragmentos de Okazaki, que são fitas descontínuas de DNA. Então, quando a DNA polimerase atinge a extremidade 5' do primer de RNA do fragmento de Okazaki anterior, ela desloca a extremidade 5' do primer em uma aba de RNA de fita simples que é removida pela clivagem da nuclease. A clivagem das abas de RNA envolve três métodos de remoção do primer. A primeira possibilidade de remoção do primer é criando um retalho curto que é removido diretamente pela endonuclease específica da estrutura do retalho 1 (FEN-1), que cliva o retalho 5' saliente. Este método é conhecido como a via de retalho curto de remoção do primer de RNA. A segunda maneira de clivar um primer de RNA é degradando a fita de RNA usando uma RNase, em eucariotos é conhecida como RNase H2. Essa enzima degrada a maior parte do primer de RNA hibridizado, exceto os nucleotídeos próximos à extremidade 5' do primer. Assim, os nucleotídeos restantes são exibidos em uma aba que é clivada usando FEN-1. O último método possível de remoção do iniciador de RNA é conhecido como via longa do retalho. Nesta via, várias enzimas são recrutadas para alongar o iniciador de RNA e, em seguida, clivá-lo. As abas são alongadas por uma helicase de 5' a 3', conhecida como Pif1. Após a adição de nucleotídeos ao flap por Pif1, o flap longo é estabilizado pela proteína de replicação A (RPA). O DNA ligado a RPA inibe a atividade ou o recrutamento de FEN1, como resultado, outra nuclease deve ser recrutada para clivar o flap. Esta segunda nuclease é a DNA2 nuclease que tem uma atividade de helicase-nuclease, que cliva a longa aba do iniciador de RNA, que então deixa para trás alguns nucleotídeos que são clivados por FEN1. Ao final, quando todos os primers de RNA foram removidos, formam-se entalhes entre os fragmentos de Okazaki que são preenchidos com desoxirribonucleotídeos por meio de uma enzima conhecida como ligase1, por meio de um processo chamado ligação.
Usos de primers sintéticos
Os primers sintéticos são oligonucleotídeos sintetizados quimicamente, geralmente de DNA, que podem ser personalizados para recozimento em um local específico no DNA modelo. Em solução, o primer hibridiza espontaneamente com o molde por meio do pareamento de bases Watson-Crick antes de ser estendido pela DNA polimerase. A capacidade de criar e personalizar primers sintéticos provou ser uma ferramenta inestimável necessária para uma variedade de abordagens de biologia molecular envolvendo a análise de DNA. Tanto o método de terminação da cadeia Sanger quanto o método “Next-Gen” de sequenciamento de DNA requerem iniciadores para iniciar a reação.
Desenho do iniciador de PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) usa um par de iniciadores personalizados para direcionar o alongamento do DNA um para o outro nas extremidades opostas da sequência que está sendo amplificada. Esses primers têm tipicamente entre 18 e 24 bases de comprimento e devem codificar apenas os locais específicos a montante e a jusante da sequência que está sendo amplificada. Um primer que pode se ligar a várias regiões ao longo do DNA irá amplificá-las todas, eliminando o propósito da PCR.
Alguns critérios devem ser levados em consideração ao projetar um par de primers de PCR. Pares de primers devem ter temperaturas de fusão semelhantes, pois o recozimento durante a PCR ocorre para ambas as fitas simultaneamente, e essa temperatura de fusão compartilhada não deve ser muito maior ou menor do que a temperatura de recozimento da reação. Um primer com um Tm (temperatura de fusão) muito maior do que a temperatura de recozimento da reação pode hibridizar incorretamente e se estender em um local incorreto ao longo da sequência de DNA. Um Tm significativamente menor do que a temperatura de recozimento pode falhar no recozimento e se estender.
Além disso, as sequências de primers precisam ser escolhidas para selecionar exclusivamente uma região do DNA, evitando a possibilidade de hibridação com uma sequência semelhante próxima. Um método comumente usado para selecionar um local de primer é a pesquisa BLAST, em que todas as regiões possíveis às quais um primer pode se ligar podem ser vistas. Tanto a sequência de nucleotídeos quanto o próprio iniciador podem ser pesquisados pelo BLAST. A ferramenta gratuita NCBI Primer-BLAST integra design de primer e pesquisa BLAST em um aplicativo, assim como produtos de software comercial como ePrime e Beacon Designer. Simulações de computador de resultados teóricos de PCR (PCR Eletrônico) podem ser realizadas para auxiliar no design do primer, fornecendo temperaturas de fusão e recozimento, etc.
A partir de 2014, muitas ferramentas on-line estão disponíveis gratuitamente para o design de primers, algumas das quais se concentram em aplicações específicas de PCR. Primers com alta especificidade para um subconjunto de moldes de DNA na presença de muitas variantes semelhantes podem ser projetados usando algum software (por exemplo, DECIPHER) ou desenvolvidos independentemente para um grupo específico de animais.
A seleção de uma região específica do DNA para a ligação do primer requer algumas considerações adicionais. Regiões com alto número de repetições de mononucleotídeos e dinucleotídeos devem ser evitadas, pois pode ocorrer formação de loop e contribuir para a mishibridização. Os primers não devem ser recozidos facilmente com outros primers na mistura; este fenômeno pode levar à produção de 'primer dímero' produtos que contaminam a solução final. Os primers também não devem recozimento forte para si mesmos, pois grampos e loops internos podem impedir o recozimento com o DNA modelo.
Ao projetar primers, bases de nucleotídeos adicionais podem ser adicionadas às extremidades traseiras de cada primer, resultando em uma sequência cap personalizada em cada extremidade da região amplificada. Uma aplicação para esta prática é o uso na clonagem TA, uma técnica especial de subclonagem semelhante à PCR, onde a eficiência pode ser aumentada pela adição de caudas AG às extremidades 5' e 3'.
Primeiros degenerados
Algumas situações podem exigir o uso de primers degenerados. São misturas de primers semelhantes, mas não idênticos. Isso pode ser conveniente ao amplificar o mesmo gene de organismos diferentes, pois as sequências provavelmente são semelhantes, mas não idênticas. Essa técnica é útil porque o próprio código genético é degenerado, o que significa que vários códons diferentes podem codificar o mesmo aminoácido. Isso permite que organismos diferentes tenham uma sequência genética significativamente diferente que codifica uma proteína altamente semelhante. Por esta razão, os primers degenerados também são usados quando o design do primer é baseado na sequência da proteína, pois a sequência específica dos códons não é conhecida. Portanto, a sequência do primer correspondente ao aminoácido isoleucina pode ser "ATH", onde A significa adenina, T para timina e H para adenina, timina ou citosina, de acordo com o código genético de cada códon, usando os símbolos IUPAC para bases degeneradas. Os primers degenerados podem não hibridizar perfeitamente com uma sequência alvo, o que pode reduzir bastante a especificidade da amplificação por PCR.
Primeiros degenerados são amplamente utilizados e extremamente úteis no campo da ecologia microbiana. Eles permitem a amplificação de genes de microorganismos até então não cultivados ou permitem a recuperação de genes de organismos onde a informação genômica não está disponível. Normalmente, os primers degenerados são projetados alinhando o sequenciamento de genes encontrados no GenBank. As diferenças entre sequências são contabilizadas usando degenerescências IUPAC para bases individuais. Os primers de PCR são então sintetizados como uma mistura de primers correspondentes a todas as permutações da sequência de códons.