Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição

Em biologia molecular, o polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) é uma técnica que explora variações em sequências homólogas de DNA, conhecidas como polimorfismos, populações ou espécies, ou para identificar as localizações dos genes dentro de uma sequência. O termo pode referir-se ao próprio polimorfismo, detectado através das diferentes localizações dos locais das enzimas de restrição, ou a uma técnica laboratorial relacionada pela qual tais diferenças podem ser ilustradas. Na análise RFLP, uma amostra de DNA é digerida em fragmentos por uma ou mais enzimas de restrição, e os fragmentos de restrição resultantes são então separados por eletroforese em gel de acordo com seu tamanho.

A análise RFLP está agora em grande parte obsoleta devido ao surgimento de tecnologias baratas de sequenciamento de DNA, mas foi a primeira técnica de perfil de DNA barata o suficiente para ter aplicação generalizada. A análise RFLP foi uma ferramenta inicial importante no mapeamento do genoma, localização de genes para doenças genéticas, determinação de risco de doenças e testes de paternidade.

Análise RFLP

A técnica básica para a detecção de RFLPs envolve a fragmentação de uma amostra de DNA com a aplicação de uma enzima de restrição, que pode clivar seletivamente uma molécula de DNA sempre que uma sequência curta e específica for reconhecida em um processo conhecido como digestão de restrição. Os fragmentos de DNA produzidos pela digestão são então separados por comprimento através de um processo conhecido como eletroforese em gel de agarose e transferidos para uma membrana através do procedimento Southern blot. A hibridização da membrana com uma sonda de ADN marcada determina então o comprimento dos fragmentos que são complementares à sonda. Diz-se que um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ocorre quando o comprimento de um fragmento detectado varia entre indivíduos, indicando homologias de sequência não idênticas. Cada comprimento de fragmento é considerado um alelo, contendo ou não uma região codificadora, e pode ser usado em análises genéticas subsequentes.

Exemplos

Existem dois mecanismos comuns pelos quais o tamanho de um fragmento de restrição específico pode variar. No primeiro esquema, um pequeno segmento do genoma está sendo detectado por uma sonda de DNA (linha mais grossa). No alelo A, o genoma é clivado por uma enzima de restrição em três locais próximos (triângulos), mas apenas o fragmento mais à direita será detectado pela sonda. No alelo a, o local de restrição 2 foi perdido por uma mutação, então a sonda agora detecta o fragmento fundido maior que vai dos locais 1 a 3. O segundo diagrama mostra como essa variação no tamanho do fragmento ficaria em um Southern blot e como cada alelo (dois por indivíduo) pode ser herdado em membros de uma família.

No terceiro esquema, a sonda e a enzima de restrição são escolhidas para detectar uma região do genoma que inclui um segmento de repetição em tandem de número variável (VNTR) (caixas no diagrama esquemático). No alelo c, existem cinco repetições no VNTR e a sonda detecta um fragmento mais longo entre os dois locais de restrição. No alelo d, existem apenas duas repetições no VNTR, portanto a sonda detecta um fragmento mais curto entre os mesmos dois locais de restrição. Outros processos genéticos, como inserções, deleções, translocações e inversões, também podem levar a polimorfismos. Os testes RFLP requerem amostras de DNA muito maiores do que os testes de repetição curta em tandem (STR).

Aplicativos

A análise da variação do RFLP nos genomas era anteriormente uma ferramenta vital no mapeamento do genoma e na análise de doenças genéticas. Se os pesquisadores estivessem tentando determinar inicialmente a localização cromossômica de um gene específico de uma doença, eles analisariam o DNA dos membros de uma família afetada pela doença e procurariam alelos RFLP que mostrassem um padrão de herança semelhante ao da doença (ver ligação genética). Uma vez localizado o gene da doença, a análise RFLP de outras famílias poderia revelar quem estava em risco de contrair a doença ou quem provavelmente seria portador dos genes mutantes. O teste RFLP é usado na identificação e diferenciação de organismos através da análise de padrões únicos no genoma. Também é utilizado na identificação da taxa de recombinação nos loci entre locais de restrição.

A análise RFLP também serviu de base para os primeiros métodos de impressão digital genética, úteis na identificação de amostras recuperadas de cenas de crimes, na determinação da paternidade e na caracterização da diversidade genética ou padrões de reprodução em populações animais.

Alternativas

A técnica de análise RFLP é, entretanto, lenta e complicada. Requer uma grande quantidade de amostra de DNA, e o processo combinado de marcação da sonda, fragmentação de DNA, eletroforese, blotting, hibridização, lavagem e autorradiografia pode levar até um mês para ser concluído. Uma versão limitada do método RFLP que usava sondas oligonucleotídicas foi relatada em 1985. Os resultados do Projeto Genoma Humano substituíram amplamente a necessidade de mapeamento RFLP e a identificação de muitos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nesse projeto (também como a identificação direta de muitos genes e mutações de doenças) substituiu a necessidade de análise de ligação de doenças RFLP (ver genotipagem de SNP). A análise dos alelos VNTR continua, mas agora é geralmente realizada por métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR). Por exemplo, os protocolos padrão para impressão digital de DNA envolvem análise PCR de painéis de mais de uma dúzia de VNTRs.

RFLP ainda é usado na seleção assistida por marcador. O polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição terminal (TRFLP ou às vezes T-RFLP) é uma técnica desenvolvida inicialmente para caracterizar comunidades bacterianas em amostras de espécies mistas. A técnica também foi aplicada a outros grupos, incluindo fungos do solo. TRFLP funciona por amplificação de DNA por PCR usando pares de primers que foram marcados com marcadores fluorescentes. Os produtos de PCR são então digeridos utilizando enzimas RFLP e os padrões resultantes visualizados utilizando um sequenciador de DNA. Os resultados são analisados simplesmente contando e comparando bandas ou picos no perfil TRFLP, ou combinando bandas de uma ou mais execuções TRFLP com um banco de dados de espécies conhecidas. Diversas ferramentas de software diferentes foram desenvolvidas para automatizar o processo de correspondência de bandas, comparação e base de dados de perfis TRFLP.

Did you mean:

The technique is similar in some aspects to temperature gradient or denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE and TGGE).

As alterações de sequência diretamente envolvidas com um RFLP também podem ser analisadas mais rapidamente por PCR. A amplificação pode ser dirigida através do sítio de restrição alterado e os produtos digeridos com a enzima de restrição. Este método foi chamado de Sequência Polimórfica Amplificada Clivada (CAPS). Alternativamente, o segmento amplificado pode ser analisado por sondas oligonucleotídicas específicas de alelo (ASO), um processo que muitas vezes pode ser feito por um simples dot blot.