Mutagênese

Mutagênese () é um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada pela produção de uma mutação. Pode ocorrer espontaneamente na natureza ou como resultado da exposição a agentes mutagênicos. Também pode ser obtido experimentalmente usando procedimentos de laboratório. Um mutagênico é um agente causador de mutação, seja ele químico ou físico, que resulta em um aumento na taxa de mutações no código genético de um organismo. Na natureza, a mutagênese pode levar ao câncer e a várias doenças hereditárias, e também é uma força motriz da evolução. A mutagênese como ciência foi desenvolvida com base nos trabalhos de Hermann Muller, Charlotte Auerbach e J. M. Robson na primeira metade do século XX.

História

O DNA pode ser modificado, natural ou artificialmente, por uma série de agentes físicos, químicos e biológicos, resultando em mutações. Hermann Muller descobriu que "altas temperaturas" têm a capacidade de mutar genes no início da década de 1920 e, em 1927, demonstraram um vínculo causal com a mutação ao experimentar uma máquina de raios-x, observando mudanças filogenéticas ao irradiar moscas-das-frutas com doses relativamente altas de raios-x. Muller observou vários rearranjos cromossômicos em seus experimentos e sugeriu a mutação como causa do câncer. A associação entre exposição à radiação e câncer já havia sido observada em 1902, seis anos após a descoberta dos raios X por Wilhelm Röntgen e a descoberta da radioatividade por Henri Becquerel. Lewis Stadler, contemporâneo de Muller, também mostrou o efeito dos raios X em mutações na cevada em 1928, e da radiação ultravioleta (UV) no milho em 1936. Na década de 1940, Charlotte Auerbach e J. M. Robson descobriram que o gás mostarda pode também causam mutações em moscas-das-frutas.

Embora as alterações no cromossomo causadas por raios-X e gás mostarda fossem prontamente observáveis pelos primeiros pesquisadores, outras alterações no DNA induzidas por outros mutagênicos não eram tão facilmente observáveis; o mecanismo pelo qual eles ocorrem pode ser complexo e levar mais tempo para se desvendar. Por exemplo, a fuligem foi sugerida como causa de câncer já em 1775, e o alcatrão de hulha demonstrou causar câncer em 1915. Posteriormente, foi demonstrado que os produtos químicos envolvidos em ambos eram hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH). Os PAHs por si só não são cancerígenos, e foi proposto em 1950 que as formas cancerígenas dos PAHs são os óxidos produzidos como metabólitos de processos celulares. O processo metabólico foi identificado na década de 1960 como catálise pelo citocromo P450, que produz espécies reativas que podem interagir com o DNA para formar adutos, ou moléculas produto resultantes da reação do DNA e, neste caso, o citocromo P450; o mecanismo pelo qual os adutos de PAH dão origem à mutação, no entanto, ainda está sob investigação.

Distinção entre mutação e dano ao DNA

Dano de DNA é uma alteração anormal na estrutura do DNA que não pode, por si só, ser replicado quando o DNA se replica. Em contraste, uma mutação é uma alteração na sequência do ácido nucleico que pode ser replicada; portanto, uma mutação pode ser herdada de uma geração para a seguinte. O dano pode ocorrer por adição química (aduto) ou interrupção estrutural de uma base de DNA (criando um nucleotídeo ou fragmento de nucleotídeo anormal) ou uma quebra em uma ou ambas as fitas de DNA. Tal dano ao DNA pode resultar em mutação. Quando o dano contendo DNA é replicado, uma base incorreta pode ser inserida na nova fita complementar enquanto ela está sendo sintetizada (consulte reparo do DNA § Síntese da translesão). A inserção incorreta na nova fita ocorrerá oposta ao local danificado na fita modelo, e essa inserção incorreta pode se tornar uma mutação (ou seja, um par de bases alterado) na próxima rodada de replicação. Além disso, quebras de fita dupla no DNA podem ser reparadas por um processo de reparo impreciso, junção de extremidades não homólogas, que produz mutações. As mutações podem normalmente ser evitadas se os sistemas precisos de reparo do DNA reconhecerem os danos no DNA e os repararem antes da conclusão da próxima rodada de replicação. Pelo menos 169 enzimas são diretamente empregadas no reparo do DNA ou influenciam os processos de reparo do DNA. Destes, 83 são empregados diretamente nos 5 tipos de processos de reparo do DNA indicados no quadro apresentado no artigo DNA repair.

O DNA nuclear de mamíferos pode sofrer mais de 60.000 episódios de danos por célula por dia, conforme listado com referências em danos ao DNA (ocorrência natural). Se não forem corrigidos, esses adutos, após replicação incorreta nos locais danificados, podem dar origem a mutações. Na natureza, as mutações que surgem podem ser benéficas ou deletérias – esta é a força motriz da evolução. Um organismo pode adquirir novas características por meio de mutação genética, mas a mutação também pode resultar no comprometimento da função dos genes e, em casos graves, causar a morte do organismo. A mutação também é uma fonte importante de aquisição de resistência a antibióticos em bactérias e a agentes antifúngicos em leveduras e bolores. Em um ambiente de laboratório, a mutagênese é uma técnica útil para gerar mutações que permite examinar detalhadamente as funções dos genes e produtos gênicos, produzindo proteínas com características aprimoradas ou novas funções, bem como cepas mutantes com propriedades úteis. Inicialmente, a capacidade da radiação e dos mutagênicos químicos de causar mutação foi explorada para gerar mutações aleatórias, mas técnicas posteriores foram desenvolvidas para introduzir mutações específicas.

Nos humanos, uma média de 60 novas mutações são transmitidas de pais para filhos. Os machos humanos, no entanto, tendem a transmitir mais mutações dependendo de sua idade, transmitindo uma média de duas novas mutações para sua progênie a cada ano adicional de idade.

Mecanismos

A mutagênese pode ocorrer endogenamente (por exemplo, hidrólise espontânea), através de processos celulares normais que podem gerar espécies reativas de oxigênio e adutos de DNA, ou através de erro na replicação e reparo do DNA. A mutagênese também pode ocorrer como resultado da presença de mutagênicos ambientais que induzem alterações no DNA de um organismo. O mecanismo pelo qual a mutação ocorre varia de acordo com o mutagênico, ou o agente causador, envolvido. A maioria dos mutagênicos age direta ou indiretamente via metabólitos mutagênicos no DNA de um organismo, produzindo lesões. Alguns mutagênicos, no entanto, podem afetar o mecanismo de replicação ou partição cromossômica e outros processos celulares.

A mutagênese também pode ser autoinduzida por organismos unicelulares quando as condições ambientais são restritivas ao crescimento do organismo, como crescimento de bactérias na presença de antibióticos, crescimento de levedura na presença de um agente antifúngico ou outro agente unicelular organismos que crescem em um ambiente carente de um nutriente essencial

Muitos mutagênicos químicos requerem ativação biológica para se tornarem mutagênicos. Um grupo importante de enzimas envolvidas na geração de metabólitos mutagênicos é o citocromo P450. Outras enzimas que também podem produzir metabólitos mutagênicos incluem glutationa S-transferase e epóxido hidrolase microssomal. Os mutagênicos que não são mutagênicos por si mesmos, mas requerem ativação biológica, são chamados de promutágenos.

Enquanto a maioria dos mutagênicos produz efeitos que resultam em erros na replicação, por exemplo, criando adutos que interferem na replicação, alguns mutagênicos podem afetar diretamente o processo de replicação ou reduzir sua fidelidade. Análogo de base, como 5-bromouracil, pode substituir a timina na replicação. Metais como cádmio, cromo e níquel podem aumentar a mutagênese de várias maneiras, além de danos diretos ao DNA, por exemplo, reduzindo a capacidade de reparar erros, bem como produzindo alterações epigenéticas.

As mutações geralmente surgem como resultado de problemas causados por lesões no DNA durante a replicação, resultando em erros na replicação. Em bactérias, danos extensos ao DNA devido a mutagênicos resultam em lacunas de DNA de fita simples durante a replicação. Isso induz a resposta SOS, um processo de reparo de emergência também sujeito a erros, gerando mutações. Em células de mamíferos, a interrupção da replicação em locais danificados induz uma série de mecanismos de resgate que ajudam a contornar as lesões do DNA, no entanto, isso também pode resultar em erros. A família Y de polimerases de DNA é especializada em desvio de lesão de DNA em um processo denominado síntese de translesão (TLS), em que essas polimerases de desvio de lesão substituem a polimerase de DNA replicativa de alta fidelidade estagnada, transitam pela lesão e estendem o DNA até que a lesão tenha passado. que a replicação normal pode ser retomada; esses processos podem ser propensos a erros ou livres de erros.

Dano de DNA e mutação espontânea

O número de episódios de danos ao DNA que ocorrem em uma célula de mamífero por dia é alto (mais de 60.000 por dia). A ocorrência frequente de danos ao DNA é provavelmente um problema para todos os organismos contendo DNA, e a necessidade de lidar com os danos ao DNA e minimizar seus efeitos deletérios é provavelmente um problema fundamental para a vida.

A maioria das mutações espontâneas provavelmente surge da síntese de trans-lesão propensa a erros após um local de dano de DNA na fita molde durante a replicação do DNA. Esse processo pode superar bloqueios potencialmente letais, mas ao custo de introduzir imprecisões no DNA filho. A relação causal do dano ao DNA com a mutação espontânea é ilustrada pelo crescimento aeróbico de E. coli, em que 89% das mutações de substituição de base que ocorrem espontaneamente são causadas por danos no DNA induzidos por espécies reativas de oxigênio (ROS). Em leveduras, mais de 60% das substituições e deleções espontâneas de pares de bases únicas são provavelmente causadas pela síntese de lesões trans.

Uma fonte significativa adicional de mutações em eucariotos é o processo impreciso de reparo de DNA não homólogo, que é frequentemente empregado no reparo de quebras de fita dupla.

Em geral, parece que a principal causa subjacente de mutação espontânea é a síntese de trans-lesões propensa a erros durante a replicação do DNA e que a via de reparo de junção final não homóloga propensa a erros também pode ser um importante contribuinte em eucariotos.

Hidrólise espontânea

O DNA não é totalmente estável em solução aquosa e pode ocorrer depurinação do DNA. Sob condições fisiológicas, a ligação glicosídica pode ser hidrolisada espontaneamente e estima-se que 10.000 locais de purina no DNA sejam depurinados a cada dia em uma célula. Numerosas vias de reparo de DNA existem para o DNA; no entanto, se o sítio apurínico não for reparado, pode ocorrer incorporação incorreta de nucleotídeos durante a replicação. A adenina é preferencialmente incorporada por DNA polimerases em um sítio apurínico.

A citidina também pode se tornar desaminada em uridina em um quinto centésimo da taxa de depurinação e pode resultar na transição de G para A. As células eucarióticas também contêm 5-metilcitosina, que se acredita estar envolvida no controle da transcrição gênica, que pode se tornar desaminada em timina.

Tautomerismo

A tautomerização é o processo pelo qual os compostos se rearranjam espontaneamente para assumir suas formas isoméricas estruturais. Por exemplo, as formas ceto (C=O) de guanina e timina podem se reorganizar em suas raras formas enol (-OH), enquanto as formas amino (-NH₂) de adenina e citosina podem resultar em as formas mais raras de imino (=NH). Na replicação do DNA, a tautomerização altera os sítios de pareamento de bases e pode causar o pareamento impróprio de bases de ácido nucléico.

Modificação de bases

As bases podem ser modificadas endogenamente por moléculas celulares normais. Por exemplo, o DNA pode ser metilado pela S-adenosilmetionina, alterando assim a expressão do gene marcado sem incorrer em uma mutação na própria sequência de DNA. A modificação de histonas é um processo relacionado no qual as proteínas histonas em torno das quais o DNA se enrola podem ser modificadas de forma semelhante via metilação, fosforilação ou acetilação; essas modificações podem atuar para alterar a expressão gênica do DNA local e também podem atuar para denotar locais de DNA danificado que precisam de reparo. O DNA também pode ser glicosilado por açúcares redutores.

Muitos compostos, como PAHs, aminas aromáticas, aflatoxinas e alcaloides pirrolizidínicos, podem formar espécies reativas de oxigênio catalisadas pelo citocromo P450. Esses metabólitos formam adutos com o DNA, que podem causar erros na replicação, e os volumosos adutos aromáticos podem formar intercalações estáveis entre as bases e bloquear a replicação. Os adutos também podem induzir alterações conformacionais no DNA. Alguns adutos também podem resultar na depurinação do DNA; é, no entanto, incerto o quão significativa tal depurinação causada pelos adutos é na geração de mutação.

A alquilação e arilação de bases podem causar erros na replicação. Alguns agentes alquilantes, como N-Nitrosaminas, podem requerer a reação catalítica do citocromo-P450 para a formação de um cátion alquil reativo. N⁷ e O⁶ de guanina e N³ e N⁷ de adenina são os mais suscetíveis ao ataque. Os adutos de N⁷-guanina formam a maior parte dos adutos de DNA, mas parecem não ser mutagênicos. A alquilação em O⁶ de guanina, no entanto, é prejudicial porque o reparo por excisão de O⁶-aduto de guanina pode ser ruim em alguns tecidos, como o cérebro. A O⁶ metilação da guanina pode resultar na transição de G para A, enquanto a O⁴-metiltimina pode ser emparelhada incorretamente com a guanina. O tipo de mutação gerada, no entanto, pode depender do tamanho e tipo do aduto, bem como da sequência de DNA.

A radiação ionizante e as espécies reativas de oxigênio geralmente oxidam a guanina para produzir 8-oxoguanina.

Setas indica quebras cromossômicas devido a danos no DNA

Danos na espinha dorsal

A radiação ionizante pode produzir radicais livres altamente reativos que podem quebrar as ligações no DNA. As quebras de fita dupla são especialmente prejudiciais e difíceis de reparar, produzindo translocação e deleção de parte de um cromossomo. Agentes alquilantes como o gás mostarda também podem causar quebras no esqueleto do DNA. O estresse oxidativo também pode gerar espécies de oxigênio altamente reativas que podem danificar o DNA. O reparo incorreto de outros danos induzidos pelas espécies altamente reativas também pode levar a mutações.

Cruzamento

As ligações covalentes entre as bases dos nucleotídeos no DNA, sejam elas na mesma fita ou em fitas opostas, são chamadas de reticulação do DNA; a reticulação do DNA pode afetar tanto a replicação quanto a transcrição do DNA e pode ser causada pela exposição a uma variedade de agentes. Alguns produtos químicos de ocorrência natural também podem promover reticulação, como psoralenos após ativação por radiação UV e ácido nitroso. A reticulação entre fitas (entre duas fitas) causa mais danos, pois bloqueia a replicação e a transcrição e pode causar quebras e rearranjos cromossômicos. Alguns reticuladores, como ciclofosfamida, mitomicina C e cisplatina, são usados como quimioterápicos anticancerígenos devido ao seu alto grau de toxicidade para células em proliferação.

Dimerização

A dimerização consiste na ligação de dois monômeros para formar um oligômero, como a formação de dímeros de pirimidina como resultado da exposição à radiação UV, que promove a formação de um anel ciclobutil entre timinas adjacentes no DNA. Nas células da pele humana, milhares de dímeros podem ser formados em um dia devido à exposição normal à luz solar. A DNA polimerase η pode ajudar a contornar essas lesões sem erros; entretanto, indivíduos com função defeituosa de reparo do DNA, como portadores de xeroderma pigmentoso, são sensíveis à luz solar e podem ser propensos ao câncer de pele.

Etídio intercalado entre dois pares de base de adenina-timina.

Clinicamente, é possível discernir se um tumor se formou como consequência direta da radiação UV por meio da análise de sequenciamento de DNA para o padrão de dimerização específico do contexto característico que ocorre devido à exposição excessiva à luz solar.

Intercalação entre bases

A estrutura planar de produtos químicos como brometo de etídio e proflavina permite que eles se insiram entre bases no DNA. Essa inserção faz com que a espinha dorsal do DNA se estique e torne mais provável a ocorrência de deslizamentos no DNA durante a replicação, uma vez que a ligação entre as fitas se torna menos estável pelo alongamento. O deslizamento direto resultará em mutação de deleção, enquanto o deslizamento reverso resultará em uma mutação de inserção. Além disso, a intercalação no DNA de antraciclinas, como daunorrubicina e doxorrubicina, interfere no funcionamento da enzima topoisomerase II, bloqueando a replicação e causando recombinação homóloga mitótica.

Mutagênese por inserção

Transposons e vírus ou retrotransposons podem inserir sequências de DNA em regiões codificantes ou elementos funcionais de um gene e resultar na inativação do gene.

Mecanismos de mutagênese adaptativa

A mutagênese adaptativa foi definida como mecanismos de mutagênese que permitem que um organismo se adapte a um estresse ambiental. Como a variedade de estresses ambientais é muito ampla, os mecanismos que a possibilitam também são bastante amplos, conforme mostram as pesquisas na área. Por exemplo, em bactérias, enquanto a modulação da resposta SOS e a síntese endógena de DNA do profago demonstraram aumentar a resistência de Acinetobacter baumannii à ciprofloxacina. Presume-se que os mecanismos de resistência estejam ligados a mutações cromossômicas intransferíveis via transferência horizontal de genes em alguns membros da família Enterobacteriaceae, como E. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp. e Enterobacter spp. Eventos cromossômicos, especialmente amplificação gênica, também parecem ser relevantes para esta mutagênese adaptativa em bactérias.

A pesquisa em células eucarióticas é muito mais escassa, mas os eventos cromossômicos também parecem ser bastante relevantes: enquanto uma recombinação intracromossômica ectópica foi relatada como envolvida na aquisição de resistência à 5-fluorocitosina em Saccharomyces cerevisiae, verificou-se que as duplicações do genoma conferem resistência em S. cerevisiae para ambientes pobres em nutrientes.

Aplicações de laboratório

No laboratório, a mutagênese é uma técnica pela qual as mutações do DNA são deliberadamente projetadas para produzir genes mutantes, proteínas ou cepas de organismos. Vários constituintes de um gene, como seus elementos de controle e seu produto gênico, podem ser mutados para que a função de um gene ou proteína possa ser examinada em detalhes. A mutação também pode produzir proteínas mutantes com propriedades alteradas ou funções aprimoradas ou novas que podem ser úteis comercialmente. Cepas mutantes de organismos que têm aplicações práticas, ou permitem que a base molecular da função celular particular seja investigada, também podem ser produzidas.

Os primeiros métodos de mutagênese produziram mutações inteiramente aleatórias; no entanto, os métodos modernos de mutagênese são capazes de produzir mutações específicas do local. Técnicas de laboratório modernas usadas para gerar essas mutações incluem:

• Mutagénese direcionada
• Mutagenesis/ PCR mutagenesis
• Mutagénese de inserção
• Assinatura marcada mutagenesis
• Mutagénese de Transposon
• Mutagénese de saturação de seqüência