Microscópio
Um microscópio (do grego antigo μικρός (mikrós) 'pequeno' e σκοπέω (skopéō) 'ver (em); examine, inspecione') é um instrumento de laboratório usado para examinar objetos que são muito pequenos para serem vistos a olho nu. Microscopia é a ciência de investigar pequenos objetos e estruturas usando um microscópio. Microscópico significa ser invisível ao olho, a menos que seja auxiliado por um microscópio.
Existem muitos tipos de microscópios, e eles podem ser agrupados de diferentes maneiras. Uma maneira é descrever o método que um instrumento usa para interagir com uma amostra e produzir imagens, seja enviando um feixe de luz ou elétrons através de uma amostra em seu caminho óptico, detectando emissões de fótons de uma amostra ou escaneando uma curta distância da superfície de uma amostra usando uma sonda. O microscópio mais comum (e o primeiro a ser inventado) é o microscópio óptico, que usa lentes para refratar a luz visível que passa por uma amostra finamente seccionada para produzir uma imagem observável. Outros tipos principais de microscópios são o microscópio de fluorescência, o microscópio eletrônico (tanto o microscópio eletrônico de transmissão quanto o microscópio eletrônico de varredura) e vários tipos de microscópios de sonda de varredura.
História
Embora objetos semelhantes a lentes remontem a 4.000 anos e existam relatos gregos sobre as propriedades ópticas de esferas cheias de água (século V aC), seguidos por muitos séculos de escritos sobre óptica, o uso mais antigo conhecido de microscópios simples (lupas) remonta ao uso generalizado de lentes em óculos no século 13. Os primeiros exemplos conhecidos de microscópios compostos, que combinam uma lente objetiva perto do espécime com uma ocular para ver uma imagem real, apareceram na Europa por volta de 1620. O inventor é desconhecido, embora muitas reivindicações tenham sido feitas ao longo dos anos. Vários giram em torno dos centros de fabricação de espetáculos na Holanda, incluindo alegações de que foi inventado em 1590 por Zacharias Janssen (reivindicação feita por seu filho) ou Zacharias' pai, Hans Martens, ou ambos, afirma que foi inventado por seu vizinho e fabricante de óculos rival, Hans Lippershey (que solicitou a patente do primeiro telescópio em 1608), e afirma que foi inventado pelo expatriado Cornelis Drebbel, que notou ter um versão em Londres em 1619. Galileo Galilei (às vezes também citado como inventor do microscópio composto) parece ter descoberto depois de 1610 que ele poderia focar seu telescópio para ver pequenos objetos e, depois de ver um microscópio composto construído por Drebbel exibido em Roma em 1624, construiu sua própria versão melhorada. Giovanni Faber cunhou o nome microscópio para o microscópio composto que Galileu submeteu à Accademia dei Lincei em 1625 (Galileu o chamou de occhiolino 'pequeno olho').
Ascensão dos microscópios de luz modernos
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O primeiro relato detalhado da anatomia microscópica do tecido orgânico com base no uso de um microscópio não apareceu até 1644, em L'occhio della mosca de Giambattista Odierna, ou O Olho da Mosca.
O microscópio ainda era uma grande novidade até as décadas de 1660 e 1670, quando naturalistas na Itália, Holanda e Inglaterra começaram a usá-los para estudar biologia. O cientista italiano Marcello Malpighi, chamado de pai da histologia por alguns historiadores da biologia, iniciou suas análises de estruturas biológicas com os pulmões. A publicação em 1665 de Micrographia de Robert Hooke teve um enorme impacto, principalmente por causa de suas impressionantes ilustrações. Uma contribuição significativa veio de Antonie van Leeuwenhoek, que alcançou uma ampliação de até 300 vezes usando um microscópio simples de lente única. Ele colocou uma lente de bola de vidro muito pequena entre os orifícios em duas placas de metal rebitadas juntas e com uma agulha ajustável por parafusos presa para montar o espécime. Então, Van Leeuwenhoek redescobriu os glóbulos vermelhos (depois de Jan Swammerdam) e os espermatozóides, e ajudou a popularizar o uso de microscópios para visualizar a ultraestrutura biológica. Em 9 de outubro de 1676, van Leeuwenhoek relatou a descoberta de microrganismos.
O desempenho de um microscópio de luz depende da qualidade e do uso correto do sistema de lentes condensadoras para focalizar a luz na amostra e da lente objetiva para capturar a luz da amostra e formar uma imagem. Os primeiros instrumentos foram limitados até que este princípio fosse totalmente apreciado e desenvolvido desde o final do século 19 até o início do século 20, e até que as lâmpadas elétricas estivessem disponíveis como fontes de luz. Em 1893, August Köhler desenvolveu um princípio fundamental de iluminação de amostra, a iluminação de Köhler, que é fundamental para alcançar os limites teóricos de resolução para o microscópio de luz. Este método de iluminação de amostras produz uma iluminação uniforme e supera o contraste e a resolução limitados impostos pelas primeiras técnicas de iluminação de amostras. Novos desenvolvimentos na iluminação de amostra vieram da descoberta do contraste de fase por Frits Zernike em 1953, e iluminação de contraste de interferência diferencial por Georges Nomarski em 1955; ambos permitem imagens de amostras transparentes não coradas.
Microscópios eletrônicos
No início do século 20, uma alternativa significativa ao microscópio de luz foi desenvolvida, um instrumento que usa um feixe de elétrons em vez de luz para gerar uma imagem. O físico alemão Ernst Ruska, trabalhando com o engenheiro elétrico Max Knoll, desenvolveu o primeiro protótipo de microscópio eletrônico em 1931, um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O microscópio eletrônico de transmissão funciona em princípios semelhantes a um microscópio óptico, mas usa elétrons no lugar da luz e eletroímãs no lugar das lentes de vidro. O uso de elétrons, em vez de luz, permite uma resolução muito maior.
O desenvolvimento do microscópio eletrônico de transmissão foi rapidamente seguido em 1935 pelo desenvolvimento do microscópio eletrônico de varredura por Max Knoll. Embora os TEMs estivessem sendo usados para pesquisa antes da Segunda Guerra Mundial e se tornassem populares depois, o SEM não estava disponível comercialmente até 1965.
Os microscópios eletrônicos de transmissão tornaram-se populares após a Segunda Guerra Mundial. Ernst Ruska, trabalhando na Siemens, desenvolveu o primeiro microscópio eletrônico de transmissão comercial e, na década de 1950, começaram a ser realizadas as principais conferências científicas sobre microscopia eletrônica. Em 1965, o primeiro microscópio eletrônico de varredura comercial foi desenvolvido pelo professor Sir Charles Oatley e seu aluno de pós-graduação Gary Stewart, e comercializado pela Cambridge Instrument Company como o "Stereoscan".
Uma das últimas descobertas sobre o uso de um microscópio eletrônico é a capacidade de identificar um vírus. Como este microscópio produz uma imagem clara e visível de pequenas organelas, em um microscópio eletrônico não há necessidade de reagentes para ver o vírus ou células nocivas, resultando em uma maneira mais eficiente de detectar patógenos.
Microscópios de sonda de varredura
De 1981 a 1983, Gerd Binnig e Heinrich Rohrer trabalharam na IBM em Zurique, Suíça, para estudar o fenômeno de tunelamento quântico. Eles criaram um instrumento prático, um microscópio de sonda de varredura da teoria quântica de tunelamento, que lê forças muito pequenas trocadas entre uma sonda e a superfície de uma amostra. A sonda se aproxima da superfície tão perto que os elétrons podem fluir continuamente entre a sonda e a amostra, criando uma corrente da superfície para a sonda. O microscópio não foi inicialmente bem recebido devido à natureza complexa das explicações teóricas subjacentes. Em 1984, Jerry Tersoff e D.R. Hamann, enquanto trabalhava nos Laboratórios Bell da AT&T em Murray Hill, Nova Jersey, começou a publicar artigos que vinculavam a teoria aos resultados experimentais obtidos pelo instrumento. Isso foi seguido de perto em 1985 com instrumentos comerciais funcionais e, em 1986, com a invenção de Gerd Binnig, Quate e Gerber do microscópio de força atômica, depois o Prêmio Nobel de Física de Binnig e Rohrer por o SPM.
Novos tipos de microscópio de sonda de varredura continuaram a ser desenvolvidos à medida que a capacidade de usinar sondas e pontas ultrafinas avançava.
Microscópios de fluorescência
Os desenvolvimentos mais recentes em microscópio de luz centram-se em grande parte no aumento da microscopia de fluorescência na biologia. Durante as últimas décadas do século 20, particularmente na era pós-genômica, muitas técnicas de coloração fluorescente de estruturas celulares foram desenvolvidas. Os principais grupos de técnicas envolvem coloração química direcionada de estruturas celulares específicas, por exemplo, o composto químico DAPI para marcar DNA, uso de anticorpos conjugados a repórteres fluorescentes, ver imunofluorescência e proteínas fluorescentes, como a proteína verde fluorescente. Essas técnicas usam esses diferentes fluoróforos para análise da estrutura celular em nível molecular em amostras vivas e fixadas.
A ascensão da microscopia de fluorescência impulsionou o desenvolvimento de um importante projeto de microscópio moderno, o microscópio confocal. O princípio foi patenteado em 1957 por Marvin Minsky, embora a tecnologia laser limitasse a aplicação prática da técnica. Não foi até 1978 quando Thomas e Christoph Cremer desenvolveram o primeiro microscópio confocal de varredura a laser prático e a técnica rapidamente ganhou popularidade na década de 1980.
Microscópios de super resolução
Muita pesquisa atual (no início do século 21) em técnicas de microscópio óptico é focada no desenvolvimento de análise de superresolução de amostras marcadas com fluorescência. A iluminação estruturada pode melhorar a resolução em cerca de duas a quatro vezes e técnicas como a microscopia de depleção por emissão estimulada (STED) estão se aproximando da resolução dos microscópios eletrônicos. Isso ocorre porque o limite de difração ocorre a partir da luz ou da excitação, o que faz com que a resolução deva ser dobrada para ficar supersaturada. Stefan Hell recebeu o Prêmio Nobel de Química de 2014 pelo desenvolvimento da técnica STED, juntamente com Eric Betzig e William Moerner, que adaptaram a microscopia de fluorescência para visualização de moléculas únicas.
Microscópios de raios X
Microscópios de raios-X são instrumentos que usam radiação eletromagnética geralmente na banda de raios-X suaves para objetos de imagem. Os avanços tecnológicos na ótica das lentes de raios-X no início dos anos 1970 tornaram o instrumento uma opção de imagem viável. Eles são frequentemente usados em tomografia (ver microtomografia computadorizada) para produzir imagens tridimensionais de objetos, incluindo materiais biológicos que não foram fixados quimicamente. Atualmente, pesquisas estão sendo feitas para melhorar a ótica de raios X duros, que têm maior poder de penetração.
Tipos
Os microscópios podem ser separados em várias classes diferentes. Um agrupamento é baseado no que interage com a amostra para gerar a imagem, ou seja, luz ou fótons (microscópios ópticos), elétrons (microscópios eletrônicos) ou uma sonda (microscópios de sonda de varredura). Alternativamente, os microscópios podem ser classificados com base na análise da amostra por meio de um ponto de varredura (microscópios ópticos confocais, microscópios eletrônicos de varredura e microscópios de sonda de varredura) ou analisam a amostra de uma só vez (microscópios ópticos de campo amplo e microscópios eletrônicos de transmissão).
Os microscópios óticos de campo amplo e os microscópios eletrônicos de transmissão utilizam ambos a teoria das lentes (ótica para microscópios de luz e lentes eletroímãs para microscópios eletrônicos) para ampliar a imagem gerada pela passagem de uma onda transmitida através da amostra, ou refletida por a amostra. As ondas utilizadas são eletromagnéticas (em microscópios ópticos) ou feixes de elétrons (em microscópios eletrônicos). A resolução nesses microscópios é limitada pelo comprimento de onda da radiação usada para gerar a imagem da amostra, onde comprimentos de onda mais curtos permitem uma resolução mais alta.
Microscópios ópticos e eletrônicos de varredura, como o microscópio confocal e o microscópio eletrônico de varredura, usam lentes para focalizar um ponto de luz ou elétrons na amostra e, em seguida, analisam os sinais gerados pelo feixe que interage com a amostra. O ponto é então escaneado sobre a amostra para analisar uma região retangular. A ampliação da imagem é obtida exibindo os dados da varredura de uma área de amostra fisicamente pequena em uma tela relativamente grande. Esses microscópios têm o mesmo limite de resolução que os microscópios ópticos de campo amplo, de sonda e eletrônicos.
Os microscópios de sonda de varredura também analisam um único ponto na amostra e, em seguida, examinam a sonda em uma região retangular da amostra para criar uma imagem. Como esses microscópios não usam radiação eletromagnética ou eletrônica para geração de imagens, eles não estão sujeitos ao mesmo limite de resolução que os microscópios ópticos e eletrônicos descritos acima.
Microscópio óptico
O tipo mais comum de microscópio (e o primeiro inventado) é o microscópio óptico. Este é um instrumento óptico contendo uma ou mais lentes que produzem uma imagem ampliada de uma amostra colocada no plano focal. Os microscópios ópticos possuem vidro refrativo (ocasionalmente de plástico ou quartzo), para focalizar a luz no olho ou em outro detector de luz. Microscópios ópticos baseados em espelho operam da mesma maneira. A ampliação típica de um microscópio de luz, assumindo a faixa de luz visível, é de até 1.250 × com um limite de resolução teórica de cerca de 0,250 micrômetros ou 250 nanômetros. Isso limita a ampliação prática a ~1.500×. Técnicas especializadas (por exemplo, microscopia confocal de varredura, Vertico SMI) podem exceder essa ampliação, mas a resolução é limitada pela difração. O uso de comprimentos de onda de luz mais curtos, como ultravioleta, é uma maneira de melhorar a resolução espacial do microscópio óptico, assim como dispositivos como o microscópio óptico de varredura de campo próximo.
Sarfus é uma técnica óptica recente que aumenta a sensibilidade de um microscópio óptico padrão a um ponto em que é possível visualizar diretamente filmes nanométricos (até 0,3 nanômetro) e nanoobjetos isolados (até 2 nm de diâmetro). A técnica é baseada no uso de substratos não refletivos para microscopia de luz refletida de polarização cruzada.
A luz ultravioleta permite a resolução de características microscópicas, bem como a geração de imagens de amostras transparentes a olho nu. A luz infravermelha próxima pode ser usada para visualizar circuitos embutidos em dispositivos de silício ligados, uma vez que o silício é transparente nessa região de comprimentos de onda.
Na microscopia de fluorescência, muitos comprimentos de onda de luz, desde o ultravioleta até o visível, podem ser usados para fazer com que as amostras fiquem fluorescentes, o que permite a visualização a olho nu ou com câmeras especificamente sensíveis.
A microscopia de contraste de fase é uma técnica de iluminação microscópica óptica na qual pequenas mudanças de fase na luz que passa por uma amostra transparente são convertidas em mudanças de amplitude ou contraste na imagem. O uso de contraste de fase não requer coloração para visualizar o slide. Esta técnica de microscópio tornou possível estudar o ciclo celular em células vivas.
O microscópio óptico tradicional evoluiu mais recentemente para o microscópio digital. Além ou em vez da visualização direta do objeto através das oculares, um tipo de sensor semelhante aos usados em uma câmera digital é usado para obter uma imagem, que é exibida em um monitor de computador. Esses sensores podem usar tecnologia CMOS ou CCD (charge-coupled device), dependendo da aplicação.
A microscopia digital com níveis de luz muito baixos para evitar danos a amostras biológicas vulneráveis está disponível usando câmeras digitais de contagem de fótons sensíveis. Foi demonstrado que uma fonte de luz que fornece pares de fótons emaranhados pode minimizar o risco de danos às amostras mais sensíveis à luz. Nesta aplicação de imagem fantasma para microscopia esparsa de fótons, a amostra é iluminada com fótons infravermelhos, cada um dos quais é espacialmente correlacionado com um parceiro emaranhado na banda visível para imagens eficientes por uma câmera de contagem de fótons.
Microscópio eletrônico
Os dois principais tipos de microscópios eletrônicos são os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) e os microscópios eletrônicos de varredura (SEMs). Ambos têm uma série de lentes eletromagnéticas e eletrostáticas para focalizar um feixe de elétrons de alta energia em uma amostra. Em um TEM, os elétrons passam pela amostra, de forma análoga à microscopia óptica básica. Isso requer uma preparação cuidadosa da amostra, uma vez que os elétrons são fortemente espalhados pela maioria dos materiais. As amostras também devem ser muito finas (abaixo de 100 nm) para que os elétrons passem por elas. Seções transversais de células coradas com ósmio e metais pesados revelam membranas de organelas claras e proteínas como ribossomos. Com um nível de resolução de 0,1 nm, é possível obter visualizações detalhadas de vírus (20 a 300 nm) e uma fita de DNA (2 nm de largura). Em contraste, o SEM possui bobinas raster para escanear a superfície de objetos a granel com um fino feixe de elétrons. Portanto, o espécime não precisa necessariamente ser seccionado, mas o revestimento com um metal nanométrico ou camada de carbono pode ser necessário para amostras não condutoras. O SEM permite imagens de superfície rápidas de amostras, possivelmente em vapor de água fino para evitar a secagem.
Sonda de digitalização
Os diferentes tipos de microscópios de sonda de varredura surgem dos muitos tipos diferentes de interações que ocorrem quando uma pequena sonda é escaneada e interage com um espécime. Essas interações ou modos podem ser registrados ou mapeados em função da localização na superfície para formar um mapa de caracterização. Os três tipos mais comuns de microscópios de sonda de varredura são microscópios de força atômica (AFM), microscópios ópticos de varredura de campo próximo (MSOM ou SNOM, microscopia óptica de campo próximo de varredura) e microscópios de tunelamento de varredura (STM). Um microscópio de força atômica tem uma sonda fina, geralmente de silício ou nitreto de silício, presa a um cantilever; a sonda é escaneada sobre a superfície da amostra e as forças que causam uma interação entre a sonda e a superfície da amostra são medidas e mapeadas. Um microscópio óptico de varredura de campo próximo é semelhante a um AFM, mas sua sonda consiste em uma fonte de luz em uma fibra óptica coberta por uma ponta que geralmente possui uma abertura para a passagem da luz. O microscópio pode capturar a luz transmitida ou refletida para medir propriedades ópticas muito localizadas da superfície, geralmente de um espécime biológico. Os microscópios de tunelamento de varredura têm uma ponta de metal com um único átomo apical; a ponta está ligada a um tubo através do qual flui uma corrente. A ponta é varrida sobre a superfície de uma amostra condutiva até que uma corrente de tunelamento flua; a corrente é mantida constante pelo movimento computadorizado da ponta e uma imagem é formada pelos movimentos registrados da ponta.
Outros tipos
Os microscópios acústicos de varredura usam ondas sonoras para medir variações na impedância acústica. Semelhantes ao Sonar em princípio, eles são usados para trabalhos como a detecção de defeitos nas subsuperfícies de materiais, incluindo aqueles encontrados em circuitos integrados. Em 4 de fevereiro de 2013, engenheiros australianos construíram um "microscópio quântico" que fornece precisão incomparável.
Aplicativos móveis
Microscópios de aplicativos móveis podem opcionalmente ser usados como microscópio óptico quando a lanterna é ativada. No entanto, os microscópios de aplicativos móveis são mais difíceis de usar devido ao ruído visual, geralmente limitados a 40x e aos limites de resolução da própria lente da câmera.