Experimento Hershey-Chase
Os experimentos Hershey-Chase foram uma série de experimentos conduzidos em 1952 por Alfred Hershey e Martha Chase que ajudaram a confirmar que o DNA é material genético.
Embora o DNA fosse conhecido pelos biólogos desde 1869, muitos cientistas ainda presumiam na época que as proteínas carregavam a informação para herança porque o DNA parecia ser uma molécula inerte e, como está localizado no núcleo, seu papel era considerado para ser o armazenamento de fósforo. Em seus experimentos, Hershey e Chase mostraram que quando bacteriófagos, que são compostos de DNA e proteína, infectam bactérias, seu DNA entra na célula bacteriana hospedeira, mas a maior parte de sua proteína não. Hershey e Chase e descobertas subsequentes serviram para provar que o DNA é o material hereditário.
A Hershey dividiu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1969 com Max Delbrück e Salvador Luria por suas "descobertas sobre a estrutura genética dos vírus".
Antecedentes históricos
No início do século XX, os biólogos pensavam que as proteínas carregavam informações genéticas. Isso foi baseado na crença de que as proteínas eram mais complexas que o DNA. A influente "hipótese do tetranucleotídeo" de Phoebus Levene, que propunha incorretamente que o DNA era um conjunto repetitivo de nucleotídeos idênticos, apoiou essa conclusão. Os resultados do experimento Avery-MacLeod-McCarty, publicados em 1944, sugeriram que o DNA era o material genético, mas ainda havia alguma hesitação dentro da comunidade científica em aceitar isso, o que preparou o terreno para o experimento Hershey-Chase.
Hershey e Chase, junto com outros que fizeram experimentos relacionados, confirmaram que o DNA era a biomolécula que carregava a informação genética. Antes disso, Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty haviam demonstrado que o DNA levava à transformação de uma cepa de Streptococcus pneumoniae em outra. Os resultados desses experimentos forneceram evidências de que o DNA era a biomolécula que carregava a informação genética.
Métodos e resultados
Hershey e Chase precisavam ser capazes de examinar diferentes partes dos fagos que estavam estudando separadamente, então eles precisavam distinguir as subseções do fago. Os vírus eram conhecidos por serem compostos de uma casca de proteína e DNA, então eles escolheram rotular cada um com um isótopo elementar diferente. Isso permitiu que cada um fosse observado e analisado separadamente. Como o fósforo está contido no DNA, mas não nos aminoácidos, o fósforo-32 radioativo foi usado para marcar o DNA contido no fago T2. Enxofre-35 radioativo foi usado para rotular as seções de proteína do fago T2, porque o enxofre está contido na proteína, mas não no DNA.
Hershey e Chase inseriram os elementos radioativos nos bacteriófagos adicionando os isótopos a meios separados dentro dos quais as bactérias foram deixadas crescer por 4 horas antes da introdução do bacteriófago. Quando os bacteriófagos infectavam as bactérias, a progênie continha os isótopos radioativos em suas estruturas. Este procedimento foi realizado uma vez para os fagos marcados com enxofre e uma vez para os fagos marcados com fósforo. A progênie marcada foi então deixada infectar bactérias não marcadas. Os revestimentos do fago permaneceram do lado de fora da bactéria, enquanto o material genético entrou. O rompimento do fago da bactéria por agitação em um misturador seguido de centrifugação permitiu a separação dos revestimentos de fago das bactérias. Estas bactérias foram lisadas para liberar a progênie do fago. A progênie dos fagos que foram marcados com fósforo radioativo permaneceu marcada, enquanto a progênie dos fagos marcados com enxofre radioativo não foi marcada. Assim, o experimento Hershey-Chase ajudou a confirmar que o DNA, e não a proteína, é o material genético.
Hershey e Chase mostraram que a introdução de desoxirribonuclease (referida como DNase), uma enzima que quebra o DNA, em uma solução contendo os bacteriófagos marcados não introduz nenhum 32P na solução. Isso demonstrou que o fago é resistente à enzima enquanto intacto. Além disso, eles foram capazes de plasmolizar os bacteriófagos para que entrassem em choque osmótico, o que efetivamente criou uma solução contendo a maior parte do 32P e uma solução mais pesada contendo estruturas chamadas "fantasmas" que continha o 35S e a capa proteica do vírus. Verificou-se que esses "fantasmas" poderia adsorver a bactérias que eram suscetíveis ao T2, embora não contivessem DNA e fossem simplesmente os restos da cápsula viral original. Eles concluíram que a proteína protegia o DNA da DNase, mas uma vez que os dois foram separados e o fago foi inativado, a DNase poderia hidrolisar o DNA do fago.
Experiência e conclusões
Hershey e Chase também conseguiram provar que o DNA do fago é inserido na bactéria logo após o vírus se ligar ao seu hospedeiro. Usando um liquidificador de alta velocidade, eles conseguiram forçar os bacteriófagos das células bacterianas após a adsorção. A falta de DNA marcado com 32P remanescente na solução depois que os bacteriófagos foram adsorvidos à bactéria mostrou que o DNA do fago foi transferido para a célula bacteriana. A presença de quase todo o 35S radioativo na solução mostrou que a capa proteica que protege o DNA antes da adsorção ficou fora da célula.
Hershey e Chase concluíram que o DNA, e não a proteína, era o material genético. Eles determinaram que um revestimento proteico protetor foi formado ao redor do bacteriófago, mas que o DNA interno é o que confere sua capacidade de produzir progênie dentro de uma bactéria. Eles mostraram que, no crescimento, a proteína não tem função, enquanto o DNA tem alguma função. Eles determinaram isso a partir da quantidade de material radioativo restante fora da célula. Apenas 20% do 32P ficou fora da célula, demonstrando que ele foi incorporado ao DNA no material genético da célula. Todo o 35S nas capas de proteína permaneceu fora da célula, mostrando que não foi incorporado à célula e que a proteína não é o material genético.
O experimento de Hershey e Chase concluiu que pouco material contendo enxofre entrou na célula bacteriana. No entanto, nenhuma conclusão específica pode ser feita sobre se o material isento de enxofre entra na célula bacteriana após a adsorção do fago. Mais pesquisas foram necessárias para concluir que se tratava apenas de bacteriófagos. DNA que entrou na célula e não uma combinação de proteína e DNA onde a proteína não continha nenhum enxofre.
Discussão
Confirmação
Hershey e Chase concluíram que a proteína provavelmente não era o material genético hereditário. No entanto, eles não tiraram nenhuma conclusão sobre a função específica do DNA como material hereditário, e apenas disseram que ele deveria ter algum papel indefinido.
A confirmação e a clareza vieram um ano depois, em 1953, quando James D. Watson e Francis Crick formularam corretamente a hipótese, em seu artigo de jornal "Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid", a dupla estrutura helicoidal do DNA e sugeriu o mecanismo de cópia pelo qual o DNA funciona como material hereditário. Além disso, Watson e Crick sugeriram que o DNA, o material genético, é responsável pela síntese de milhares de proteínas encontradas nas células. Eles fizeram essa proposta com base na semelhança estrutural existente entre as duas macromoléculas: tanto a proteína quanto o DNA são sequências lineares de monômeros (aminoácidos e nucleotídeos, respectivamente).
Outras experiências
Depois que o experimento Hershey-Chase foi publicado, a comunidade científica em geral reconheceu que o DNA era o material do código genético. Essa descoberta levou a uma investigação mais detalhada do DNA para determinar sua composição, bem como sua estrutura 3D. Usando cristalografia de raios X, a estrutura do DNA foi descoberta por James Watson e Francis Crick com a ajuda de evidências experimentais documentadas anteriormente por Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. O conhecimento da estrutura do DNA levou os cientistas a examinar a natureza do código genético e, por sua vez, entender o processo de síntese de proteínas. George Gamow propôs que o código genético era composto de sequências de três pares de bases de DNA conhecidas como trigêmeos ou códons que representam um dos vinte aminoácidos. A codificação genética ajudou os pesquisadores a entender o mecanismo da expressão gênica, o processo pelo qual a informação de um gene é usada na síntese de proteínas. Desde então, muitas pesquisas foram realizadas para modular as etapas do processo de expressão gênica. Essas etapas incluem transcrição, splicing de RNA, tradução e modificação pós-traducional que são usadas para controlar a natureza química e estrutural das proteínas. Além disso, a engenharia genética dá aos engenheiros a capacidade de manipular diretamente os materiais genéticos dos organismos usando técnicas de DNA recombinante. A primeira molécula de DNA recombinante foi criada por Paul Berg em 1972, quando ele combinou o DNA do vírus de macaco SV40 com o do fago lambda.
Experimentos em material hereditário durante a época do experimento Hershey-Chase frequentemente usavam bacteriófagos como organismo modelo. Os bacteriófagos se prestam a experimentos com material hereditário porque incorporam seu material genético ao material genético de suas células hospedeiras (tornando-os ferramentas úteis), multiplicam-se rapidamente e são facilmente coletados por pesquisadores.
Legado
O experimento Hershey-Chase, seus predecessores, como o experimento Avery-MacLeod-McCarty, e sucessores serviram para estabelecer inequivocamente que a informação hereditária era transportada pelo DNA. Esta descoberta tem inúmeras aplicações em ciência forense, investigação criminal e genealogia. Ele forneceu o conhecimento básico para outras aplicações em análise forense de DNA, onde a impressão digital de DNA usa dados originários do DNA, não de fontes de proteínas, para deduzir a variação genética.