Enzima de restrição
Uma enzima de restrição, endonuclease de restrição, REase, ENase ou restrictase é uma enzima que cliva o DNA em fragmentos em ou próximos a locais de reconhecimento específicos dentro de moléculas conhecidas como locais de restrição. As enzimas de restrição são uma classe do grupo mais amplo de enzimas endonucleases. As enzimas de restrição são comumente classificadas em cinco tipos, que diferem em sua estrutura e se cortam seu substrato de DNA no local de reconhecimento ou se os locais de reconhecimento e clivagem são separados um do outro. Para cortar o DNA, todas as enzimas de restrição fazem duas incisões, uma vez através de cada estrutura açúcar-fosfato (ou seja, cada fita) da dupla hélice do DNA.
Essas enzimas são encontradas em bactérias e arquéias e fornecem um mecanismo de defesa contra vírus invasores. Dentro de um procarioto, as enzimas de restrição cortam seletivamente o DNA estranho em um processo chamado digestão de restrição; enquanto isso, o DNA hospedeiro é protegido por uma enzima modificadora (uma metiltransferase) que modifica o DNA procariótico e bloqueia a clivagem. Juntos, esses dois processos formam o sistema de modificação de restrições.
São conhecidas mais de 3.600 endonucleases de restrição que representam mais de 250 especificidades diferentes. Mais de 3.000 deles foram estudados detalhadamente e mais de 800 deles estão disponíveis comercialmente. Essas enzimas são usadas rotineiramente para modificação de DNA em laboratórios e são uma ferramenta vital na clonagem molecular.
Histórico
O termo enzima de restrição originou-se dos estudos do fago λ, um vírus que infecta bactérias, e do fenômeno de restrição e modificação controlada pelo hospedeiro de tal fago bacteriano ou bacteriófago. O fenômeno foi identificado pela primeira vez em trabalhos realizados nos laboratórios de Salvador Luria, Jean Weigle e Giuseppe Bertani no início da década de 1950. Verificou-se que, para um bacteriófago λ que pode crescer bem numa estirpe de Escherichia coli, por exemplo E. coli C, quando cultivada em outra cepa, por exemplo E. coli K, seus rendimentos podem cair significativamente, em até 3-5 ordens de grandeza. A célula hospedeira, neste exemplo E. coli K, é conhecido como hospedeiro restritivo e parece ter a capacidade de reduzir a atividade biológica do fago λ. Se um fago se estabelecer em uma cepa, a capacidade desse fago de crescer também ficará restrita em outras cepas. Na década de 1960, foi demonstrado em trabalhos realizados nos laboratórios de Werner Arber e Matthew Meselson que a restrição é causada por uma clivagem enzimática do DNA do fago, e a enzima envolvida foi, portanto, denominada enzima de restrição.
As enzimas de restrição estudadas por Arber e Meselson eram enzimas de restrição do tipo I, que separam o DNA aleatoriamente do local de reconhecimento. Em 1970, Hamilton O. Smith, Thomas Kelly e Kent Wilcox isolaram e caracterizaram a primeira enzima de restrição tipo II, HindII, da bactéria Haemophilus influenzae. Enzimas de restrição desse tipo são mais úteis para trabalhos de laboratório, pois clivam o DNA no local de sua sequência de reconhecimento e são as mais comumente usadas como ferramenta de biologia molecular. Mais tarde, Daniel Nathans e Kathleen Danna mostraram que a clivagem do DNA do vírus símio 40 (SV40) por enzimas de restrição produz fragmentos específicos que podem ser separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, mostrando assim que enzimas de restrição também podem ser usadas para mapear DNA. Por seu trabalho na descoberta e caracterização de enzimas de restrição, o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1978 foi concedido a Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton O. Smith. A descoberta de enzimas de restrição permite a manipulação do DNA, levando ao desenvolvimento de tecnologia de DNA recombinante que tem muitas aplicações, por exemplo, permitindo a produção em larga escala de proteínas como a insulina humana utilizada por pacientes diabéticos.
Origens
As enzimas de restrição provavelmente evoluíram de um ancestral comum e se espalharam por meio da transferência horizontal de genes. Além disso, há evidências crescentes de que as endonucleases de restrição evoluíram como um elemento genético egoísta.
Site de reconhecimento
As enzimas de restrição reconhecem uma sequência específica de nucleotídeos e produzem um corte de fita dupla no DNA. As sequências de reconhecimento também podem ser classificadas pelo número de bases em seu sítio de reconhecimento, geralmente entre 4 e 8 bases, e o número de bases na sequência determinará com que frequência o sítio aparecerá por acaso em qualquer genoma, por exemplo, um A sequência de pares de 4 bases teoricamente ocorreria uma vez a cada 4 ^ 4 ou 256 pb, 6 bases, 4 ^ 6 ou 4.096 pb, e 8 bases seriam 4 ^ 8 ou 65.536 pb. Muitos deles são palindrômicos, o que significa que a sequência de bases é lida de trás para frente. Em teoria, existem dois tipos de sequências palindrômicas que podem ser possíveis no DNA. O palíndromo semelhante a um espelho é semelhante aos encontrados em texto comum, em que uma sequência é lida da mesma forma para frente e para trás em uma única fita de DNA, como em GTAATG. O palíndromo de repetição invertida também é uma sequência que lê o mesmo para frente e para trás, mas as sequências para frente e para trás são encontradas em fitas complementares de DNA (ou seja, de DNA de fita dupla), como em GTATAC (GTATAC sendo complementar ao CATATG). Palíndromos de repetição invertida são mais comuns e têm maior importância biológica do que palíndromos espelhados.
A digestão EcoRI produz partículas "pegajosas" termina,
enquanto a clivagem da enzima de restrição SmaI produz resultados "cegos" termina:
As sequências de reconhecimento no DNA diferem para cada enzima de restrição, produzindo diferenças no comprimento, sequência e orientação da fita (extremidade 5' ou extremidade 3') de uma extremidade aderente "saliência" de uma restrição enzimática.
Diferentes enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência são conhecidas como neoesquizômeros. Freqüentemente, eles clivam em diferentes locais da sequência. Diferentes enzimas que reconhecem e clivam no mesmo local são conhecidas como isosquizômeros.
Tipos
As endonucleases de restrição de ocorrência natural são categorizadas em cinco grupos (Tipos I, II, III, IV e V) com base em sua composição e requisitos de cofatores enzimáticos, na natureza de sua sequência alvo e na posição relativa de seu local de clivagem de DNA. para a sequência alvo. A análise da sequência de DNA das enzimas de restrição mostra, entretanto, grandes variações, indicando que existem mais de quatro tipos. Todos os tipos de enzimas reconhecem sequências curtas específicas de DNA e realizam a clivagem endonucleolítica do DNA para fornecer fragmentos específicos com 5'-fosfatos terminais. Eles diferem em sua sequência de reconhecimento, composição de subunidades, posição de clivagem e requisitos de cofatores, conforme resumido abaixo:
- As enzimas tipo I (EC 3.1.21.3) cleave em locais remotos de um local de reconhecimento; exigem tanto ATP e S-adenosyl-L-metionina para funcionar; proteína multifuncional com ambas as atividades de digestão de restrição e metilase (EC 2.1.1.72).
- As enzimas tipo II (EC 3.1.21.4) clivam dentro ou a curtas distâncias específicas de um local de reconhecimento; a maioria requer enzimas de magnésio; única função (digestão de restrições) independentes da metilase.
- As enzimas tipo III (EC 3.1.21.5) desencadeiam em locais a uma curta distância de um local de reconhecimento; exigem ATP (mas não hidrolisam); S-adenosyl-L-metionina estimula a reação, mas não é necessária; existem como parte de um complexo com uma metilase de modificação (EC 2.1.1.72).
- As enzimas tipo IV visam DNA modificado, por exemplo, metilado, hidroximetilado e glucosil-hidroximetilado DNA
- As enzimas tipo V utilizam RNAs guia (gRNAs)
Tipo l
As enzimas de restrição do tipo I foram as primeiras a serem identificadas e foram identificadas pela primeira vez em duas cepas diferentes (K-12 e B) de E. coli. Essas enzimas cortam em um local diferente e a uma distância aleatória (pelo menos 1.000 pb) de seu local de reconhecimento. A clivagem nestes locais aleatórios segue um processo de translocação de DNA, o que mostra que estas enzimas também são motores moleculares. O sítio de reconhecimento é assimétrico e composto por duas porções específicas – uma contendo 3–4 nucleotídeos e outra contendo 4–5 nucleotídeos – separadas por um espaçador não específico de cerca de 6–8 nucleotídeos. Estas enzimas são multifuncionais e são capazes de restringir atividades de digestão e modificação, dependendo do estado de metilação do DNA alvo. Os cofatores S-adenosil metionina (AdoMet), adenosina trifosfato hidrolisado (ATP) e íons magnésio (Mg2+) são necessários para sua plena atividade. As enzimas de restrição do tipo I possuem três subunidades chamadas HsdR, HsdM e HsdS; HsdR é necessário para digestão de restrição; HsdM é necessário para adicionar grupos metil ao DNA hospedeiro (atividade de metiltransferase), e HsdS é importante para a especificidade do local de reconhecimento (ligação ao DNA), além da atividade de digestão de restrição (clivagem de DNA) e de modificação (DNA metiltransferase).
Tipo II
As enzimas de restrição do tipo II típicas diferem das enzimas de restrição do tipo I de várias maneiras. Eles formam homodímeros, com locais de reconhecimento que geralmente são indivisos e palindrômicos e têm de 4 a 8 nucleotídeos de comprimento. Eles reconhecem e clivam o DNA no mesmo local e não usam ATP ou AdoMet para sua atividade – geralmente requerem apenas Mg2+ como cofator. Essas enzimas clivam a ligação fosfodiéster da dupla hélice do DNA. Ele pode clivar no centro de ambos os fios para produzir uma extremidade romba ou em uma posição escalonada, deixando saliências chamadas pontas adesivas. Estas são as enzimas de restrição mais comumente disponíveis e usadas. Na década de 1990 e início de 2000, foram descobertas novas enzimas desta família que não seguiam todos os critérios clássicos desta classe de enzimas, e uma nova nomenclatura de subfamília foi desenvolvida para dividir esta grande família em subcategorias baseadas em desvios das características típicas das enzimas do tipo II.. Esses subgrupos são definidos usando um sufixo de letra.
As enzimas de restrição do tipo IIB (por exemplo, BcgI e BplI) são multímeros, contendo mais de uma subunidade. Eles clivam o DNA em ambos os lados do seu reconhecimento para eliminar o local de reconhecimento. Eles requerem cofatores AdoMet e Mg2+. As endonucleases de restrição do tipo IIE (por exemplo, NaeI) clivam o DNA após interação com duas cópias de sua sequência de reconhecimento. Um sítio de reconhecimento atua como alvo de clivagem, enquanto o outro atua como um efetor alostérico que acelera ou melhora a eficiência da clivagem enzimática. Semelhante às enzimas do tipo IIE, as endonucleases de restrição do tipo IIF (por exemplo, NgoMIV) interagem com duas cópias da sua sequência de reconhecimento, mas clivam ambas as sequências ao mesmo tempo. As endonucleases de restrição do tipo IIG (por exemplo, RM.Eco57I) possuem uma única subunidade, como as enzimas de restrição clássicas do tipo II, mas requerem que o cofator AdoMet esteja ativo. As endonucleases de restrição do tipo IIM, como DpnI, são capazes de reconhecer e cortar DNA metilado. As endonucleases de restrição do tipo IIS (por exemplo, FokI) clivam o DNA a uma distância definida dos seus locais de reconhecimento assimétricos não palindrômicos; esta característica é amplamente utilizada para realizar técnicas de clonagem in vitro, como a clonagem Golden Gate. Estas enzimas podem funcionar como dímeros. Da mesma forma, as enzimas de restrição do Tipo IIT (por exemplo, Bpu10I e BslI) são compostas por duas subunidades diferentes. Alguns reconhecem sequências palindrômicas, enquanto outros possuem locais de reconhecimento assimétricos.
Tipo III
As enzimas de restrição do tipo III (por exemplo, EcoP15) reconhecem duas sequências não palindrômicas separadas que são orientadas inversamente. Eles cortaram o DNA cerca de 20 a 30 pares de bases após o local de reconhecimento. Estas enzimas contêm mais de uma subunidade e requerem cofatores AdoMet e ATP para seus papéis na metilação do DNA e na digestão de restrição, respectivamente. Eles são componentes de mecanismos de modificação de restrição do DNA procariótico que protegem o organismo contra a invasão de DNA estranho. As enzimas do tipo III são proteínas multifuncionais heterooligoméricas compostas por duas subunidades, Res (P08764) e Mod (P08763). A subunidade Mod reconhece a sequência de DNA específica para o sistema e é uma metiltransferase modificada; como tal, é funcionalmente equivalente às subunidades M e S da endonuclease de restrição tipo I. Res é necessário para a digestão de restrição, embora não tenha atividade enzimática por si só. As enzimas do tipo III reconhecem sequências curtas de DNA assimétricas de 5 a 6 pb de comprimento e clivam 25 a 27 pb a jusante para deixar sequências curtas de fita simples de 5' saliências. Eles requerem a presença de dois locais de reconhecimento não metilados orientados inversamente para que ocorra a digestão de restrição. Essas enzimas metilam apenas uma fita do DNA, na posição N-6 dos resíduos de adenosil, de modo que o DNA recém-replicado terá apenas uma fita metilada, o que é suficiente para proteger contra a digestão por restrição. As enzimas do tipo III pertencem à subfamília beta das N6 adenina metiltransferases, contendo os nove motivos que caracterizam esta família, incluindo o motivo I, a bolsa de ligação AdoMet (FXGXG), e o motivo IV, a região catalítica (S/D/N (PP) S/F).Tipo IV
As enzimas do tipo IV reconhecem DNA modificado, normalmente metilado, e são exemplificadas pelos sistemas McrBC e Mrr de E. coli.
Tipo V
As enzimas de restrição do tipo V (por exemplo, o complexo cas9-gRNA dos CRISPRs) utilizam RNAs guia para atingir sequências não palindrômicas específicas encontradas em organismos invasores. Eles podem cortar DNA de comprimento variável, desde que seja fornecido um RNA guia adequado. A flexibilidade e facilidade de uso dessas enzimas as tornam promissoras para futuras aplicações em engenharia genética.
Enzimas de restrição artificiais
Enzimas de restrição artificiais podem ser geradas pela fusão de um domínio de ligação ao DNA natural ou projetado a um domínio de nuclease (geralmente o domínio de clivagem da enzima de restrição do tipo IIS FokI). Tais enzimas de restrição artificiais podem atingir grandes sítios de DNA (até 36 pb) e podem ser manipuladas para se ligarem às sequências de DNA desejadas. As nucleases de dedo de zinco são as enzimas de restrição artificiais mais comumente usadas e geralmente são usadas em aplicações de engenharia genética, mas também podem ser usadas para aplicações de clonagem de genes mais padrão. Outras enzimas de restrição artificiais baseiam-se no domínio de ligação ao DNA dos efetores TAL.
Em 2013, uma nova tecnologia CRISPR-Cas9, baseada num sistema de defesa viral procariótico, foi projetada para editar o genoma e foi rapidamente adotada em laboratórios. Para obter mais detalhes, leia CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas).
Em 2017, um grupo da Universidade de Illinois relatou o uso de uma proteína Argonaute retirada de Pyrococcus furiosus (PfAgo) junto com DNA guia para editar DNA in vitro como restrição artificial enzimas.
Também foram desenvolvidas ribonucleases artificiais que atuam como enzimas de restrição para o RNA. Um sistema baseado em PNA, denominado PNAzyme, possui um grupo Cu(II)-2,9-dimetilfenantrolina que imita ribonucleases para sequência específica de RNA e cliva em uma região não pareada de bases (protuberância de RNA) do RNA alvo formado quando a enzima se liga ao RNA. Esta enzima mostra seletividade ao clivar apenas em um local que não possui incompatibilidade ou é cineticamente preferido dentre dois possíveis locais de clivagem.
Nomenclatura
| Derivação do nome EcoRI | ||
|---|---|---|
| Abreviação | Significado | Descrição |
| E | Escherichia | género |
| co | coli | espécies específicas |
| R | RY13 | tensão |
| Eu... | Primeira identificação | ordem de identificação na bactéria |
Desde a sua descoberta na década de 1970, muitas enzimas de restrição foram identificadas; por exemplo, foram caracterizadas mais de 3.500 enzimas de restrição do Tipo II diferentes. Cada enzima recebe o nome da bactéria da qual foi isolada, usando um sistema de nomenclatura baseado no gênero, espécie e cepa bacteriana. Por exemplo, o nome da enzima de restrição EcoRI foi derivado conforme mostrado na caixa.
Aplicativos
Enzimas de restrição isoladas são usadas para manipular o DNA para diferentes aplicações científicas.
Eles são usados para auxiliar a inserção de genes em vetores plasmídicos durante experimentos de clonagem de genes e produção de proteínas. Para uso ideal, os plasmídeos comumente usados para clonagem de genes são modificados para incluir uma sequência poliligante curta (chamada de sítio de clonagem múltipla, ou MCS) rica em sequências de reconhecimento de enzimas de restrição. Isto permite flexibilidade ao inserir fragmentos de genes no vetor plasmídico; os locais de restrição contidos naturalmente nos genes influenciam a escolha da endonuclease para digerir o DNA, uma vez que é necessário evitar a restrição do DNA desejado enquanto se corta intencionalmente as extremidades do DNA. Para clonar um fragmento de gene em um vetor, tanto o DNA plasmídico quanto a inserção do gene são normalmente cortados com as mesmas enzimas de restrição e depois colados com a ajuda de uma enzima conhecida como DNA ligase.
As enzimas de restrição também podem ser usadas para distinguir alelos genéticos, reconhecendo especificamente alterações de base única no DNA, conhecidas como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). No entanto, isto só é possível se um SNP alterar o sítio de restrição presente no alelo. Neste método, a enzima de restrição pode ser usada para genotipar uma amostra de DNA sem a necessidade de sequenciamento genético caro. A amostra é primeiro digerida com a enzima de restrição para gerar fragmentos de DNA e, em seguida, os fragmentos de tamanhos diferentes são separados por eletroforese em gel. Em geral, alelos com sítios de restrição corretos gerarão duas bandas visíveis de DNA no gel, e aqueles com sítios de restrição alterados não serão cortados e gerarão apenas uma única banda. Também pode ser gerado um mapa de DNA por digestão de restrição que pode fornecer as posições relativas dos genes. Os diferentes comprimentos de DNA gerados pela digestão de restrição também produzem um padrão específico de bandas após eletroforese em gel e podem ser usados para impressão digital de DNA.
De maneira semelhante, enzimas de restrição são usadas para digerir DNA genômico para análise genética por Southern blot. Esta técnica permite aos investigadores identificar quantas cópias (ou parálogos) de um gene estão presentes no genoma de um indivíduo, ou quantas mutações genéticas (polimorfismos) ocorreram dentro de uma população. O último exemplo é denominado polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP).
Enzimas de restrição artificiais criadas pela ligação do domínio de clivagem do DNA FokI com uma matriz de proteínas de ligação ao DNA ou matrizes de dedo de zinco, denominadas nucleases de dedo de zinco (ZFN), são uma ferramenta poderosa para edição do genoma do hospedeiro devido à sua especificidade de sequência aprimorada. ZFN trabalha em pares, sendo sua dimerização mediada in-situ através do domínio FokI. Cada matriz de dedo de zinco (ZFA) é capaz de reconhecer de 9 a 12 pares de bases, perfazendo 18 a 24 para o par. Um espaçador de 5 a 7 pb entre os locais de clivagem aumenta ainda mais a especificidade da ZFN, tornando-a uma ferramenta segura e mais precisa que pode ser aplicada em humanos. Foi realizado um recente ensaio clínico de Fase I de ZFN para a abolição direcionada do co-receptor CCR5 para o HIV-1.
Outros propuseram usar o sistema RM de bactérias como modelo para desenvolver genes antivirais humanos ou vacinas e terapias genômicas, uma vez que o sistema RM desempenha um papel de defesa inato nas bactérias, restringindo o tropismo por bacteriófagos. Existem pesquisas sobre REases e ZFN que podem clivar o DNA de vários vírus humanos, incluindo HSV-2, HPVs de alto risco e HIV-1, com o objetivo final de induzir mutagênese alvo e aberrações de vírus que infectam humanos. O genoma humano já contém restos de genomas retrovirais que foram inativados e aproveitados para ganho próprio. De fato, os mecanismos para silenciar os retroelementos genômicos L1 ativos pelas três exonucleases de reparo principal 1 (TREX1) e pela complementação cruzada de reparo de excisão 1 (ERCC) parecem imitar a ação dos sistemas RM em bactérias e a junção final não homóloga (NHEJ) que segue o uso da ZFN sem gabarito de reparo.Exemplos
Exemplos de enzimas de restrição incluem:
| Enzima | Fonte | Sequência de reconhecimento | Corta. |
|---|---|---|---|
| EcoRI | Escherichia coli | 5'GAATTC 3 | 5... ' 3... ' |
| EcoRII | Escherichia coli | 5'CCWGG 3'GGWCC | 5... CCWGG--3 ' 3'-- GGWCC ---5 ' |
| BamHI | Informação relacionada | 5'GATCC 3'CCTAGG | 5... GATCC...-3 ' 3... ' |
| HindIII | Influenza Humana | 5'AAGCTT 3'TTCGAA | 5... A AGCTT...-3 ' 3... ' |
| TaqI | Termus aquaticus | 5'TCGA 3 | 5... T CGA...-3 ' 3... ' |
| Não. | Nocardia otitidis | 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGGGGG | 5'-- GC GGCCGC---3 ' 3'-- CGCCGG CG---5 ' |
| HinFI | Influenza Humana | 5'GANTC 3 | 5... G ANTC...-3 ' 3... ' |
| Saudações | Estatísticas | 5'GATC 3 | 5... GATC--3 ' 3'--CTAG ---5 ' |
| Pvull! | Proteus vulgar | 5'CAGCTG 3'GTCGAC | 5... CAG CTG...-3 ' 3'-- GTC GAC--5 ' |
| SmaI | Serratia marcescens | 5'CCCGGG 3'GGGCCC | 5'-- CCC GGGG---3 ' 3'--GGG CCC--5 ' |
| HaeIII. | Haemophilus aegyptius | 5'GGCC 3'CCGG | 5... GG CC--3 ' 3'-- CC GG---5 ' |
| HgaI | Haemophilus gallinarum | 5'GACGC 3'CTGCG | 5'--NN NN---3 ' 3'--NN NN---5 ' |
| AluI | Arthrobacter luteus | 5 3'TCGA | 5'--- AG CT--3 ' 3... ' |
| EcoRV* | Escherichia coli | 5'GATATC 3 | 5... ' 3... ' |
| EcoP15I | Escherichia coli | 5'CAGCAGN25NN 3'GTCGTCN25NN | 5...25 NN--3 ' 3...25NN ---5 ' |
| KpnI | Klebsiella pneumoniae | 5'GGTACC 3'CCATGG | 5... ' 3... CATGG---5 ' |
| PstI | InformaçÃμes sobre o assunto | 5'CTGCAG 3'GACGTC | 5... CTGCA G...-3 ' 3'--G ACGTC---5 ' |
| SacI | Streptomyces achromogenes | 5'GAGCTC 3'CTCGAG | 5... ' 3... TCGAG---5 ' |
| Sal | Streptomyces albus | 5'GTCGAC 3'CAGCTG | 5... G TCGAC...-3 ' 3... ' |
| ScaI | Streptomyces caespitosus | 5 3'TCATGA | 5... AGT ACT...-3 ' 3'-- TCA TGA---5 ' |
| Feitiços | Sphaerotilus natans | 5 3'TGATCA | 5'-- Um CTAGT---3 ' 3'-- TGATC A--5 ' |
| SphI | Streptomyces phaeochromogenes | 5'GCATGC 3'CGTACG | 5... ' 3... GTACG--5 ' |
| StuI | Extintores de incêndio | 5'AGGCCT 3'TCCGGA | 5... ' 3'--- TCGGA---5 ' |
| XbaI | Xanthomonas badrii | 5'TCTAGA 3 | 5... T CTAGA...-3 ' 3... ' |
Chave:
* = pontas rombas
N = C ou G ou T ou A
W = A ou T
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