Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose é um método de eletroforese em gel usado em bioquímica, biologia molecular, genética e química clínica para separar uma população mista de macromoléculas como DNA ou proteínas em uma matriz de agarose, uma dos dois principais componentes do ágar. As proteínas podem ser separadas por carga e/ou tamanho (a eletroforese de agarose com foco isoelétrico é essencialmente independente do tamanho) e os fragmentos de DNA e RNA por comprimento. As biomoléculas são separadas pela aplicação de um campo elétrico para mover as moléculas carregadas através de uma matriz de agarose, e as biomoléculas são separadas por tamanho na matriz de gel de agarose.
O gel de agarose é fácil de fundir, tem relativamente menos grupos carregados e é particularmente adequado para separar o DNA da faixa de tamanho mais frequentemente encontrada em laboratórios, o que explica a popularidade de seu uso. O DNA separado pode ser visualizado com corante, mais comumente sob luz ultravioleta, e os fragmentos de DNA podem ser extraídos do gel com relativa facilidade. A maioria dos géis de agarose usados está entre 0,7–2% dissolvido em um tampão de eletroforese adequado.
Propriedades do gel de agarose
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O gel de agarose é uma matriz tridimensional formada por moléculas helicoidais de agarose em feixes superenrolados que são agregados em estruturas tridimensionais com canais e poros através dos quais as biomoléculas podem passar. A estrutura 3-D é mantida unida por pontes de hidrogênio e pode, portanto, ser interrompida pelo aquecimento de volta ao estado líquido. A temperatura de fusão é diferente da temperatura de gelificação, dependendo das fontes, o gel de agarose tem uma temperatura de gelificação de 35–42 °C e uma temperatura de fusão de 85–95 °C. Também estão disponíveis agaroses de baixa fusão e baixa gelificação feitas por meio de modificações químicas.
O gel de agarose tem tamanho de poro grande e boa força de gel, tornando-o adequado como um meio anticonvecção para a eletroforese de DNA e grandes moléculas de proteína. O tamanho do poro de um gel a 1% foi estimado de 100 nm a 200–500 nm, e sua força de gel permite que géis tão diluídos quanto 0,15% formem uma placa para eletroforese em gel. Os géis de baixa concentração (0,1–0,2%) são frágeis e, portanto, difíceis de manusear. O gel de agarose tem menor poder de resolução do que o gel de poliacrilamida para DNA, mas tem uma faixa maior de separação e, portanto, é usado para fragmentos de DNA geralmente de 50 a 20.000 pb de tamanho. O limite de resolução para eletroforese em gel de agarose padrão é de cerca de 750 kb, mas a resolução de mais de 6 Mb é possível com eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Também pode ser usado para separar proteínas grandes e é a matriz preferida para a eletroforese em gel de partículas com raios efetivos maiores que 5–10 nm. Um gel de agarose 0,9% tem poros grandes o suficiente para a entrada do bacteriófago T4.
O polímero de agarose contém grupos carregados, em particular piruvato e sulfato. Esses grupos carregados negativamente criam um fluxo de água na direção oposta ao movimento do DNA em um processo chamado eletroendosmose (EEO) e podem, portanto, retardar o movimento do DNA e causar o desfoque das bandas. Géis de maior concentração teriam maior fluxo eletroendosmótico. A agarose de baixo EEO é, portanto, geralmente preferida para uso em eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos, mas a agarose de alto EEO pode ser usada para outros fins. O menor teor de sulfato da agarose de baixo EEO, particularmente da agarose de baixo ponto de fusão (LMP), também é benéfico nos casos em que o DNA extraído do gel deve ser usado para manipulação posterior, pois a presença de sulfatos contaminantes pode afetar alguns procedimentos subsequentes, como como ligação e PCR. As agaroses zero EEO, no entanto, são indesejáveis para algumas aplicações, pois podem ser produzidas pela adição de grupos carregados positivamente e esses grupos podem afetar as reações enzimáticas subsequentes. A eletroendosmose é uma razão pela qual a agarose é usada preferencialmente ao agar, pois o componente agaropectina no agar contém uma quantidade significativa de sulfato carregado negativamente e grupos carboxila. A remoção de agaropectina em agarose reduz substancialmente o EEO, bem como reduz a adsorção não específica de biomoléculas à matriz do gel. No entanto, para algumas aplicações, como a eletroforese de proteínas séricas, um EEO alto pode ser desejável e agaropectina pode ser adicionada ao gel usado.
Migração de ácidos nucleicos em gel de agarose
Fatores que afetam a migração de ácido nucleico em gel
Vários fatores podem afetar a migração de ácidos nucléicos: a dimensão dos poros do gel (concentração do gel), o tamanho do DNA que está sendo submetido à eletroforese, a voltagem usada, a força iônica do tampão e a concentração de corante intercalado, como como brometo de etídio se usado durante a eletroforese.
Moléculas menores viajam mais rápido do que moléculas maiores em gel, e o DNA de fita dupla se move a uma taxa que é inversamente proporcional ao logaritmo do número de pares de bases. Essa relação, entretanto, se rompe com fragmentos de DNA muito grandes, e a separação de fragmentos de DNA muito grandes requer o uso de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corrente alternada de diferentes direções e os grandes fragmentos de DNA são separados à medida que se reorientam com o mudando de campo.
Para eletroforese em gel de agarose padrão, moléculas maiores são resolvidas melhor usando um gel de baixa concentração, enquanto moléculas menores se separam melhor em gel de alta concentração. Géis de maior concentração, no entanto, requerem tempos de execução mais longos (às vezes dias).
O movimento do DNA pode ser afetado pela conformação da molécula de DNA, por exemplo, o DNA superenrolado geralmente se move mais rápido do que o DNA relaxado porque é bem enrolado e, portanto, mais compacto. Em uma preparação de DNA plasmidial normal, múltiplas formas de DNA podem estar presentes. A eletroforese em gel dos plasmídeos normalmente mostraria a forma superenrolada negativa como a banda principal, enquanto o DNA cortado (forma circular aberta) e a forma circular fechada relaxada aparecem como bandas secundárias. A taxa na qual as várias formas se movem, no entanto, pode mudar usando diferentes condições de eletroforese, e a mobilidade do DNA circular maior pode ser mais fortemente afetada do que o DNA linear pelo tamanho dos poros do gel.
O brometo de etídio que se intercala no DNA circular pode alterar a carga, o comprimento, bem como a super-helicidade da molécula de DNA, portanto sua presença no gel durante a eletroforese pode afetar seu movimento. Por exemplo, a carga positiva do brometo de etídio pode reduzir o movimento do DNA em 15%. A eletroforese em gel de agarose pode ser usada para resolver o DNA circular com diferentes topologias de superenrolamento.
Danos no DNA devido ao aumento da reticulação também reduzirão a migração eletroforética do DNA de maneira dependente da dose.
A taxa de migração do DNA é proporcional à voltagem aplicada, ou seja, quanto maior a voltagem, mais rápido o DNA se move. A resolução de grandes fragmentos de DNA, no entanto, é menor em alta voltagem. A mobilidade do DNA também pode mudar em um campo instável – em um campo que é periodicamente invertido, a mobilidade do DNA de um determinado tamanho pode cair significativamente em uma determinada frequência de ciclagem. Esse fenômeno pode resultar em inversão de banda na eletroforese em gel de inversão de campo (FIGE), em que fragmentos de DNA maiores se movem mais rapidamente do que os menores.
Anomalias de migração
- Géis "Smiley" - este efeito de borda é causado quando a tensão aplicada é muito alta para a concentração de gel usado.
- Sobrecarga de DNA - sobrecarga de DNA diminui a migração de fragmentos de DNA.
- Contenção - presença de impurezas, como sais ou proteínas pode afetar o movimento do DNA.
Mecanismo de migração e separação
A carga negativa de seu esqueleto de fosfato move o DNA em direção ao ânodo carregado positivamente durante a eletroforese. No entanto, a migração de moléculas de DNA em solução, na ausência de uma matriz de gel, é independente do peso molecular durante a eletroforese. A matriz de gel é, portanto, responsável pela separação do DNA por tamanho durante a eletroforese, e existem vários modelos para explicar o mecanismo de separação de biomoléculas na matriz de gel. Um amplamente aceito é o modelo de Ogston, que trata a matriz polimérica como uma peneira. Uma proteína globular ou um DNA espiral aleatório se move através dos poros interconectados, e é mais provável que o movimento de moléculas maiores seja impedido e retardado por colisões com a matriz de gel, e as moléculas de tamanhos diferentes podem, portanto, ser separadas neste processo de peneiramento..
O modelo de Ogston, no entanto, quebra para moléculas grandes em que os poros são significativamente menores que o tamanho da molécula. Para moléculas de DNA de tamanho superior a 1 kb, um modelo de reptação (ou suas variantes) é mais comumente usado. Este modelo assume que o DNA pode rastejar em uma estrutura "semelhante a uma cobra" forma (daí "reptation") através dos poros como uma molécula alongada. Um modelo de reptação tendenciosa se aplica a uma força de campo elétrico mais alta, em que a extremidade dianteira da molécula torna-se fortemente polarizada na direção direta e puxa o resto da molécula junto. A microscopia de fluorescência em tempo real de moléculas coradas, no entanto, mostrou uma dinâmica mais sutil durante a eletroforese, com o DNA mostrando uma elasticidade considerável à medida que se estende alternadamente na direção do campo aplicado e depois se contrai em uma bola, ou se torna enganchado em forma de U quando fica preso nas fibras de polímero.
Procedimento geral
Os detalhes de um experimento de eletroforese em gel de agarose podem variar dependendo dos métodos, mas a maioria segue um procedimento geral.
Fundição de gel
O gel é preparado dissolvendo o pó de agarose em um tampão apropriado, como TAE ou TBE, para ser usado na eletroforese. A agarose é dispersa no tampão antes de aquecê-lo até próximo do ponto de ebulição, mas evite a ebulição. A agarose derretida deve esfriar o suficiente antes de despejar a solução em um molde, pois o molde pode entortar ou rachar se a solução de agarose estiver muito quente. Um pente é colocado no molde para criar poços para carregar a amostra, e o gel deve ser completamente endurecido antes do uso.
A concentração do gel afeta a resolução da separação do DNA. O gel de agarose é composto por poros microscópicos através dos quais as moléculas passam, e existe uma relação inversa entre o tamanho dos poros do gel de agarose e a concentração – o tamanho dos poros diminui à medida que a densidade das fibras de agarose aumenta. A alta concentração de gel melhora a separação de moléculas de DNA menores, enquanto a redução da concentração de gel permite que grandes moléculas de DNA sejam separadas. O processo permite que fragmentos que variam de 50 pares de bases a vários megabases sejam separados dependendo da concentração de gel utilizada. A concentração é medida em peso de agarose sobre o volume de tampão utilizado (g/ml). Para uma eletroforese em gel de agarose padrão, um gel de 0,8% fornece boa separação ou resolução de grandes fragmentos de DNA de 5 a 10 kb, enquanto o gel de 2% fornece boa resolução para pequenos fragmentos de 0,2 a 1 kb. Géis a 1% são freqüentemente usados para uma eletroforese padrão. Os géis de alta porcentagem geralmente são quebradiços e podem não endurecer uniformemente, enquanto os géis de baixa porcentagem (0,1-0,2%) são frágeis e difíceis de manusear. Os géis de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) também são mais frágeis do que o gel de agarose normal. A agarose de baixo ponto de fusão pode ser usada sozinha ou simultaneamente com agarose padrão para a separação e isolamento do DNA. PFGE e FIGE são frequentemente feitos com géis de agarose de alta porcentagem.
Carregamento de amostras
Depois que o gel endureceu, o pente é removido, deixando poços onde as amostras de DNA podem ser carregadas. O tampão de carregamento é misturado com a amostra de DNA antes que a mistura seja carregada nos poços. O tampão de carregamento contém um composto denso, que pode ser glicerol, sacarose ou Ficoll, que aumenta a densidade da amostra para que a amostra de DNA possa afundar no fundo do poço. Se a amostra de DNA contiver etanol residual após sua preparação, ela pode flutuar para fora do poço. O buffer de carregamento também inclui corantes coloridos, como xileno cianol e azul de bromofenol, usados para monitorar o progresso da eletroforese. As amostras de DNA são carregadas usando uma pipeta.
Eletroforese
A eletroforese em gel de agarose é mais comumente feita horizontalmente em um modo subaquático, em que o gel da placa é completamente submerso no tampão durante a eletroforese. Também é possível, mas menos comum, realizar a eletroforese verticalmente, bem como horizontalmente com o gel levantado em pernas de agarose usando um aparelho apropriado. O tampão usado no gel é o mesmo que o tampão de corrida no tanque de eletroforese, e é por isso que a eletroforese no modo subaquático é possível com gel de agarose.
Para resolução ideal de DNA maior que 2 kb em eletroforese em gel padrão, recomenda-se 5 a 8 V/cm (a distância em cm refere-se à distância entre os eletrodos, portanto essa voltagem recomendada seria de 5 a 8 multiplicado pela distância entre os eletrodos em cm). A voltagem também pode ser limitada pelo fato de aquecer o gel e pode fazer com que o gel derreta se for executado em alta voltagem por um período prolongado, especialmente se o gel usado for gel de agarose LMP. Uma voltagem muito alta também pode reduzir a resolução, bem como causar faixas de banda para grandes moléculas de DNA. Uma voltagem muito baixa pode levar ao alargamento da banda para pequenos fragmentos de DNA devido à dispersão e difusão.
Como o DNA não é visível na luz natural, o progresso da eletroforese é monitorado usando corantes coloridos. O xileno cianol (cor azul claro) comigra grandes fragmentos de DNA, enquanto o azul de bromofenol (azul escuro) comigra com os fragmentos menores. Os corantes menos usados incluem Cresol Red e Orange G, que migram antes do azul de bromofenol. Um marcador de DNA também é executado em conjunto para a estimativa do peso molecular dos fragmentos de DNA. Observe, no entanto, que o tamanho de um DNA circular como plasmídeos não pode ser medido com precisão usando marcadores padrão, a menos que tenha sido linearizado por digestão de restrição; alternativamente, um marcador de DNA superenrolado pode ser usado.
Coloração e visualização
O DNA, assim como o RNA, são normalmente visualizados por coloração com brometo de etídio, que se intercala nos sulcos principais do DNA e fluoresce sob luz ultravioleta. A intercalação depende da concentração de DNA e assim, uma banda com alta intensidade indicará maior quantidade de DNA em relação a uma banda de menor intensidade. O brometo de etídio pode ser adicionado à solução de agarose antes de gelificar, ou o gel de DNA pode ser corado posteriormente após a eletroforese. A descoloração do gel não é necessária, mas pode produzir imagens melhores. Outros métodos de coloração estão disponíveis; exemplos são SYBR Green, GelRed, azul de metileno, azul de cresil brilhante, sulfato de azul do Nilo e violeta de cristal. SYBR Green, GelRed e outros produtos comerciais similares são vendidos como alternativas mais seguras ao brometo de etídio, pois demonstrou ser mutagênico no teste de Ames, embora a carcinogenicidade do brometo de etídio não tenha sido realmente estabelecida. O SYBR Green requer o uso de um transiluminador de luz azul. O DNA corado com cristal violeta pode ser visualizado sob luz natural sem o uso de um transiluminador UV, o que é uma vantagem, mas pode não produzir uma banda forte.
Quando corado com brometo de etídio, o gel é visualizado com um transiluminador ultravioleta (UV). A luz ultravioleta excita os elétrons dentro do anel aromático do brometo de etídio e, uma vez que eles retornam ao estado fundamental, a luz é liberada, fazendo com que o DNA e o complexo de brometo de etídio fiquem fluorescentes. Os transiluminadores padrão usam comprimentos de onda de 302/312 nm (UV-B), no entanto, a exposição do DNA à radiação UV por apenas 45 segundos pode produzir danos ao DNA e afetar os procedimentos subsequentes, por exemplo, reduzindo a eficiência da transformação, transcrição in vitro e PCR. A exposição do DNA à radiação ultravioleta, portanto, deve ser limitada. O uso de um comprimento de onda mais alto de 365 nm (intervalo UV-A) causa menos danos ao DNA, mas também produz fluorescência muito mais fraca com brometo de etídio. Onde vários comprimentos de onda podem ser selecionados no transiluminador, o comprimento de onda mais curto pode ser usado para capturar imagens, enquanto o comprimento de onda mais longo deve ser usado se for necessário trabalhar no gel por um longo período de tempo.
O aparelho transiluminador também pode conter dispositivos de captura de imagem, como uma câmera digital ou polaroid, que permitem que uma imagem do gel seja tirada ou impressa.
Para eletroforese em gel de proteínas, as bandas podem ser visualizadas com Coomassie ou manchas de prata.
Procedimentos downstream
As bandas de DNA separadas são frequentemente usadas para procedimentos adicionais, e uma banda de DNA pode ser cortada do gel como uma fatia, dissolvida e purificada. No entanto, os contaminantes podem afetar alguns procedimentos a jusante, como PCR, e a agarose de baixo ponto de fusão pode ser preferida em alguns casos, pois contém menos sulfatos que podem afetar algumas reações enzimáticas. Os géis também podem ser usados para técnicas de mancha.
Buffers
Em geral, o buffer ideal deve ter boa condutividade, produzir menos calor e ter uma vida longa. Existem vários tampões usados para eletroforese em agarose; os mais comuns para ácidos nucléicos incluem Tris/Acetate/EDTA (TAE) e Tris/Borate/EDTA (TBE). Os tampões usados contêm EDTA para inativar muitas nucleases que requerem cátion divalente para sua função. O borato no tampão TBE pode ser problemático, pois o borato pode polimerizar e/ou interagir com dióis cis, como os encontrados no RNA. TAE tem a capacidade de buffer mais baixa, mas fornece a melhor resolução para DNA maior. Isso significa uma tensão mais baixa e mais tempo, mas um produto melhor.
Muitos outros buffers foram propostos, por ex. borato de lítio (LB), histidina isoelétrica, tampões pK combinados, etc.; na maioria dos casos, a lógica pretendida é uma corrente mais baixa (menos calor) e/ou mobilidades de íons correspondentes, o que leva a uma vida útil mais longa do buffer. O tampão tris-fosfato tem alta capacidade de tamponamento, mas não pode ser usado se o DNA extraído for usado em uma reação sensível ao fosfato. LB é relativamente novo e é ineficaz na resolução de fragmentos maiores que 5 kbp; No entanto, com sua baixa condutividade, uma voltagem muito maior poderia ser usada (até 35 V/cm), o que significa um tempo de análise menor para eletroforese de rotina. Uma diferença de tamanho tão baixa quanto um par de bases pode ser resolvida em gel de agarose a 3% com um meio de condutividade extremamente baixa (borato de lítio 1 mM).
Outro sistema de tamponamento pode ser usado em aplicações específicas, por exemplo, tampões de ácido barbitúrico-barbitúrico de sódio ou Tris-barbitúrico podem ser usados para eletroforese de proteínas em gel de agarose, por exemplo, na detecção de distribuição anormal de proteínas.
Aplicativos
- Estimativa do tamanho das moléculas de DNA após digestão com enzimas de restrição, por exemplo, no mapeamento de restrição do DNA clonado.
- Estimativa da concentração de DNA comparando a intensidade da banda de ácido nucleico com a faixa correspondente do marcador de tamanho.
- Análise de produtos de uma reação em cadeia de polimerase (PCR), por exemplo, em diagnóstico genético molecular ou impressão digital genética
- Separação de fragmentos de DNA para extração e purificação.
- Separação de DNA genômico restrito antes da transferência do sul, ou de RNA antes da transferência do norte.
- Separação de proteínas, por exemplo, rastreamento de anormalidades proteicas na química clínica.
Os géis de agarose são facilmente fundidos e manuseados em comparação com outras matrizes e os ácidos nucleicos não são alterados quimicamente durante a eletroforese. As amostras também são facilmente recuperadas. Após o término do experimento, o gel resultante pode ser armazenado em um saco plástico na geladeira.
A eletroforese é realizada em soluções tampão para reduzir as mudanças de pH devido ao campo elétrico, o que é importante porque a carga do DNA e do RNA depende do pH, mas funcionar por muito tempo pode esgotar a capacidade tampão da solução. Além disso, diferentes preparações de material genético podem não migrar consistentemente umas com as outras, por razões morfológicas ou outras.