DNA complementar

Saída de um CDNA microarray usado em testes

Na genética, DNA complementar (cDNA) é o DNA sintetizado a partir de um modelo de RNA de fita simples (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou microRNA (miRNA)) em uma reação catalisada pela enzima transcriptase reversa. O cDNA é frequentemente usado para expressar uma proteína específica em uma célula que normalmente não expressa essa proteína (ou seja, expressão heteróloga), ou para sequenciar ou quantificar moléculas de mRNA usando métodos baseados em DNA (qPCR, RNA-seq). O cDNA que codifica uma proteína específica pode ser transferido para uma célula receptora para expressão, geralmente sistemas de expressão bacterianos ou de levedura. O cDNA também é gerado para analisar perfis transcriptômicos em tecido volumoso, células únicas ou núcleos únicos em ensaios como microarrays, qPCR e RNA-seq.

O cDNA também é produzido naturalmente por retrovírus (como HIV-1, HIV-2, vírus da imunodeficiência símia, etc.) e depois integrado ao genoma do hospedeiro, onde cria um provírus.

O termo cDNA também é usado, normalmente em um contexto de bioinformática, para se referir a uma sequência de transcrição de mRNA, expressa como bases de DNA (desoxi-GCAT) em vez de bases de RNA (GCAU).

Síntese

O RNA serve como modelo para a síntese de cDNA. Na vida celular, o cDNA é gerado por vírus e retrotransposons para integração do RNA no DNA genômico alvo. Na biologia molecular, o RNA é purificado a partir do material de origem após a remoção do DNA genômico, proteínas e outros componentes celulares. O cDNA é então sintetizado através da transcrição reversa in vitro.

Purificação de RNA

O RNA é transcrito a partir do DNA genômico nas células hospedeiras e é extraído primeiro pela lise das células e depois pela purificação do RNA utilizando métodos amplamente utilizados, como fenol-clorofórmio, coluna de sílica e métodos de extração de RNA baseados em esferas. Os métodos de extração variam dependendo do material de origem. Por exemplo, a extração de RNA do tecido vegetal requer reagentes adicionais, como polivinilpirrolidona (PVP), para remover compostos fenólicos, carboidratos e outros compostos que, de outra forma, tornariam o RNA inutilizável. Para remover DNA e proteínas, enzimas como DNase e Proteinase K são usadas para degradação. É importante ressaltar que a integridade do RNA é mantida pela inativação de RNases com agentes caotrópicos, como isotiocianato de guanidínio, dodecil sulfato de sódio (SDS), fenol ou clorofórmio. O RNA total é então separado de outros componentes celulares e precipitado com álcool. Existem vários kits comerciais para extrações de RNA simples e rápidas para aplicações específicas. Métodos adicionais baseados em esferas podem ser usados para isolar subtipos específicos de RNA......(por exemplo, mRNA e microRNA) com base no tamanho ou regiões únicas de RNA.

Transcrição reversa

Síntese da primeira fita

Usando uma enzima transcriptase reversa e modelos de RNA purificados, uma fita de cDNA é produzida (síntese da primeira fita de cDNA). A transcriptase reversa M-MLV do vírus da leucemia murina de Moloney é comumente usada devido à sua reduzida atividade de RNase H adequada para a transcrição de RNAs mais longos. A transcriptase reversa AMV do vírus da mieloblastose aviária também pode ser usada para modelos de RNA com estruturas secundárias fortes (ou seja, alta temperatura de fusão). O cDNA é comumente gerado a partir de mRNA para análises de expressão gênica, como RT-qPCR e RNA-seq. O mRNA é transcrito reversa seletivamente usando primers oligo-dT que são o complemento reverso da cauda poliadenilada no 3' fim de todo mRNA. Uma mistura otimizada de primers oligo-dT e hexâmeros aleatórios aumenta a chance de obter cDNA completo enquanto reduz 5' ou 3' viés. O RNA ribossômico também pode ser esgotado para enriquecer tanto o mRNA quanto os transcritos não poliadenilados, como alguns RNA não codificantes.

Síntese da segunda fita

O resultado das sínteses de primeira cadeia, híbridos de RNA-DNA, pode ser processado por meio de vários métodos de síntese de segunda cadeia ou processado diretamente em ensaios a jusante. Um método antigo conhecido como síntese de grampo de cabelo baseava-se na formação de grampo de cabelo no 3' final da primeira fita de cDNA para iniciar a síntese da segunda fita. No entanto, o priming é aleatório e a hidrólise em grampo leva à perda de informações. O Procedimento de Gubler e Hoffman usa E. Coli RNase H para cortar o mRNA que é substituído por E. Coli DNA Polimerase I e selado com E. Coli DNA Ligase. Uma otimização deste procedimento depende da baixa atividade de RNase H de M-MLV para cortar o mRNA com o restante do RNA posteriormente removido pela adição de RNase H após a tradução da DNA Polimerase do cDNA de segunda fita. Isso evita a perda de informações de sequência no 5' final do mRNA.

Aplicativos

O DNA complementar é freqüentemente usado na clonagem de genes ou como sondas de genes ou na criação de uma biblioteca de cDNA. Quando os cientistas transferem um gene de uma célula para outra a fim de expressar o novo material genético como uma proteína na célula receptora, o cDNA será adicionado ao receptor (em vez do gene inteiro), porque o DNA de um gene inteiro pode incluir DNA que não codifica a proteína ou que interrompe a sequência de codificação da proteína (por exemplo, íntrons). As sequências parciais de cDNAs são frequentemente obtidas como etiquetas de sequência expressas.

Com a amplificação de sequências de DNA via reação em cadeia da polimerase (PCR) agora comum, normalmente se conduz a transcrição reversa como uma etapa inicial, seguida de PCR para obter uma sequência exata de cDNA para expressão intracelular. Isto é conseguido através da concepção de iniciadores de ADN específicos de sequência que hibridam com o 5' e 3' extremidades de uma região de cDNA que codifica uma proteína. Uma vez amplificada, a sequência pode ser cortada em cada extremidade com nucleases e inserida em uma das muitas pequenas sequências circulares de DNA conhecidas como vetores de expressão. Esses vetores permitem a auto-replicação, dentro das células, e potencialmente a integração no DNA do hospedeiro. Eles normalmente também contêm um promotor forte para conduzir a transcrição do cDNA alvo em mRNA, que é então traduzido em proteína.

Em 13 de junho de 2013, a Suprema Corte dos Estados Unidos decidiu no caso Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, embora os genes humanos de ocorrência natural não possam ser patenteados, o cDNA é elegível para patente porque não não ocorrem naturalmente.

O cDNA também é usado para estudar a expressão gênica por meio de métodos como RNA-seq ou RT-qPCR. Para sequenciamento, o RNA deve ser fragmentado devido a limitações de tamanho da plataforma de sequenciamento. Além disso, o cDNA sintetizado pela segunda fita deve ser ligado com adaptadores que permitem que os fragmentos de cDNA sejam amplificados por PCR e se liguem às células de fluxo de sequenciamento. Os métodos de análise específicos do gene geralmente usam microarrays e RT-qPCR para quantificar os níveis de cDNA via fluorometria e outros métodos.

Vírus e retrotransposons

Alguns vírus também usam cDNA para transformar seu RNA viral em mRNA (RNA viral → cDNA → mRNA). O mRNA é usado para fazer proteínas virais para assumir a célula hospedeira.

Um exemplo dessa primeira etapa do RNA viral para o cDNA pode ser visto no ciclo de infecção do HIV. Aqui, a membrana da célula hospedeira se liga ao envelope lipídico do vírus, o que permite que o capsídeo viral com duas cópias do RNA do genoma viral entre no hospedeiro. A cópia do cDNA é então feita através da transcrição reversa do RNA viral, um processo facilitado pela chaperona CypA e uma transcriptase reversa associada ao capsídeo viral.

O cDNA também é gerado por retrotransposons em genomas eucarióticos. Os retrotransposons são elementos genéticos móveis que se movem dentro e, às vezes, entre genomas por meio de intermediários de RNA. Este mecanismo é compartilhado com vírus com exclusão da geração de partículas infecciosas.