Β-Galactosidase
β-Galactosidase (EC 3.2.1.23, lactase, beta-gal ou β-gal; nome sistemático β-D-galactosídeo galactohidrolase), é uma enzima glicosídeo hidrolase que catalisa a hidrólise de resíduos terminais não redutores de β-D-galactose em β-D-galactosídeos.
β-Galactosídeos incluem carboidratos contendo galactose onde a ligação glicosídica fica acima da molécula de galactose. Os substratos de diferentes β-galactosidases incluem gangliosídeo GM1, lactosilceramidas, lactose e várias glicoproteínas.
Função
β-Galactosidase é uma exoglicosidase que hidrolisa a ligação β-glicosídica formada entre uma galactose e sua porção orgânica. Também pode clivar fucosídeos e arabinosídeos, mas com eficiência muito menor. É uma enzima essencial no corpo humano. Deficiências na proteína podem resultar em galactosialidose ou síndrome de Morquio B. Em E. coli, o gene lacZ é o gene estrutural da β-galactosidase; que está presente como parte do sistema induzível operon lac que é ativado na presença de lactose quando o nível de glicose está baixo. A síntese de β-galactosidase é interrompida quando os níveis de glicose são suficientes.
A β-galactosidase possui muitos homólogos baseados em sequências semelhantes. Alguns são β-galactosidase evoluída (EBG), β-glucosidase, 6-fosfo-β-galactosidase, β-manosidase e lactase-florizina hidrolase. Embora possam ser estruturalmente semelhantes, todos têm funções diferentes. Beta-gal é inibido pela L-ribose e pelos inibidores competitivos 2-feniletil 1-tio-β-D-galactopiranosídeo (PETG), D-galactonolactona, isopropil tio- β-D-galactosídeo (IPTG) e galactose.
A β-galactosidase é importante para os organismos, pois é um fornecedor chave na produção de energia e uma fonte de carbono através da decomposição da lactose em galactose e glicose. Também é importante para a comunidade intolerante à lactose, pois é responsável pela produção de leite e outros produtos lácteos sem lactose. Muitos humanos adultos não possuem a enzima lactase, que tem a mesma função da β-galactosidase, por isso não são capazes de digerir adequadamente os laticínios. A β-galactose é usada em produtos lácteos como iogurte, creme de leite e alguns queijos que são tratados com a enzima para quebrar qualquer lactose antes do consumo humano. Nos últimos anos, a β-galactosidase tem sido pesquisada como um tratamento potencial para a intolerância à lactose através de terapia de substituição genética, onde pode ser colocada no DNA humano para que os indivíduos possam decompor a lactose por conta própria.
Estrutura
Os 1.023 aminoácidos de E. coli β-galactosidase foram sequenciadas em 1983, e sua estrutura determinada onze anos depois, em 1994. A proteína é um homotetrâmero de 464 kDa com simetria de 2,2,2 pontos. Cada unidade de β-galactosidase consiste em cinco domínios; o domínio 1 é um barril β do tipo gelatina, os domínios 2 e 4 são barris do tipo fibronectina tipo III, o domínio 5 é um novo sanduíche β, enquanto o domínio central 3 é um barril do tipo TIM distorcido, sem a quinta hélice com uma distorção na sexta vertente.
O terceiro domínio contém o site ativo. O sítio ativo é composto de elementos de duas subunidades do tetrâmero, e a dissociação do tetrâmero em dímeros remove elementos críticos do sítio ativo. A sequência amino-terminal da β-galactosidase, o peptídeo α envolvido na complementação α, participa de uma interface de subunidade. Seus resíduos 22-31 ajudam a estabilizar um feixe de quatro hélices que forma a maior parte dessa interface, e os resíduos 13 e 15 também contribuem para a interface de ativação. Estas características estruturais fornecem uma justificativa para o fenômeno da complementação α, onde a deleção do segmento amino-terminal resulta na formação de um dímero inativo.
Reação
A β-galactosidase pode catalisar três reações diferentes nos organismos. Em um deles, ele pode passar por um processo chamado transgalactosilação para produzir alolactose, criando um ciclo de feedback positivo para a produção de β-galactose. A alolactose também pode ser clivada para formar monossacarídeos. Também pode hidrolisar a lactose em galactose e glicose, que irão prosseguir para a glicólise. O sítio ativo da β-galactosidase catalisa a hidrólise de seu substrato dissacarídeo por via "rasa" (site não produtivo) e "profundo" (site produtivo) vinculação. Galactosídeos como PETG e IPTG se ligarão no local raso quando a enzima estiver em estado "aberto" conformação, enquanto análogos do estado de transição, como L-ribose e D-galactonolactona, se ligarão no local profundo quando a conformação estiver "fechada".
A reação enzimática consiste em duas etapas químicas, galactosilação e desgalactosilação. A galactosilação é a primeira etapa química na reação em que Glu461 doa um próton a um oxigênio glicosídico, resultando na ligação covalente da galactose com Glu537. Na segunda etapa, a desgalactosilação, a ligação covalente é quebrada quando o Glu461 aceita um próton, substituindo a galactose por água. Dois estados de transição ocorrem no sítio profundo da enzima durante a reação, uma vez após cada etapa. Quando a água participa da reação, forma-se galactose, caso contrário, quando a D-glicose atua como aceptor na segunda etapa, ocorre a transgalactosilação. Foi medido cineticamente que tetrâmeros únicos da proteína catalisam reações a uma taxa de 38.500 ± 900 reações por minuto. Íons de potássio monovalentes (K+), bem como íons de magnésio divalentes (Mg2+) são necessários para a atividade ideal da enzima. A ligação β do substrato é clivada por um grupo carboxila terminal na cadeia lateral de um ácido glutâmico.
Em E. coli, pensava-se que Glu-461 era o nucleófilo na reação de substituição. No entanto, sabe-se agora que Glu-461 é um catalisador ácido. Em vez disso, Glu-537 é o nucleófilo real, ligando-se a um intermediário galactosil. Em humanos, o nucleófilo da reação de hidrólise é Glu-268. Gly794 é importante para a atividade da β-galactosidase. É responsável por colocar a enzima em uma conformação "fechada", ligada por ligante ou "aberta". conformação, agindo como uma "dobradiça" para o loop do site ativo. As diferentes conformações garantem que apenas a ligação preferencial ocorra no sítio ativo. Na presença de um substrato lento, a atividade do Gly794 aumentou, bem como um aumento na galactosilação e diminuição na desgalactosilação.
Aplicativos
O ensaio de β-galactosidase é usado frequentemente em genética, biologia molecular e outras ciências biológicas. Uma enzima ativa pode ser detectada usando substrato cromogênico artificial 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo, X-gal. A β-galactosidase clivará a ligação glicosídica em X-gal e formará galactose e 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol que dimeriza e oxida em 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro- índigo, um produto azul intenso, fácil de identificar e quantificar. É usado, por exemplo, em tela azul branca. Sua produção pode ser induzida por um análogo não hidrolisável da alolactose, IPTG, que se liga e libera o repressor lac do operador lac, permitindo assim que o início da transcrição prossiga.
É comumente usado em biologia molecular como marcador repórter para monitorar a expressão genética. Também exibe um fenômeno denominado complementação α que forma a base para a triagem azul/branco de clones recombinantes. Esta enzima pode ser dividida em dois peptídeos, LacZα e LacZΩ, nenhum dos quais é ativo por si só, mas quando ambos estão presentes juntos, remontam espontaneamente em uma enzima funcional. Esta propriedade é explorada em muitos vetores de clonagem onde a presença do gene lacZα em um plasmídeo pode complementar em trans outro gene mutante que codifica o LacZΩ em cepas laboratoriais específicas de E. coli. No entanto, quando fragmentos de ADN são inseridos no vector, a produção de LacZα é interrompida, pelo que as células não apresentam actividade de β-galactosidase. A presença ou ausência de uma β-galactosidase ativa pode ser detectada por X-gal, que produz um corante azul característico quando clivado pela β-galactosidase, proporcionando assim um meio fácil de distinguir a presença ou ausência de produto clonado num plasmídeo. Em estudos de translocações cromossômicas de leucemia, Dobson e colegas usaram uma proteína de fusão de LacZ em camundongos, explorando a tendência da β-galactosidase de oligomerizar para sugerir um papel potencial para a oligomericidade na função da proteína de fusão MLL.
Um estudo recente realizado em 2020–2021 determinou que a atividade da Beta-Galactosidase se correlaciona com a senescência das células. A senescência das células pode ser interpretada como células que não se dividem, mas células que não morrem. A atividade da beta-galactosidase pode ser superexpressa e isso pode levar a várias doenças que afetam uma ampla gama de sistemas corporais. Esses sistemas incluem o sistema cardiovascular, o sistema esquelético e muitos mais. A detecção de células senescentes pode ser alcançada medindo a atividade da beta-galactosidase lisossomal.
Uma nova isoforma para beta-galactosidase com atividade ideal em pH 6,0 (Senescence Associated beta-gal ou SA-beta-gal) que é expressa especificamente na senescência (a parada irreversível do crescimento das células). Foram ainda desenvolvidos ensaios quantitativos específicos para a sua detecção. No entanto, sabe-se agora que isto se deve a uma sobre-expressão e acumulação da beta-galactosidase endógena lisossomal, e a sua expressão não é necessária para a senescência. No entanto, continua a ser o biomarcador mais utilizado para células senescentes e envelhecidas, porque é fiável e fácil de detectar.
Evolução
Algumas espécies de bactérias, incluindo E. coli, possuem genes adicionais de β-galactosidase. Um segundo gene, chamado gene evoluído da β-galactosidase (ebgA) foi descoberto quando cepas com o gene lacZ foram deletadas (mas ainda contendo o gene da galactosídeo permease, lacY ), foram plaqueados em meio contendo lactose (ou outros 3-galactosídeos) como única fonte de carbono. Depois de algum tempo, certas colônias começaram a crescer. No entanto, a proteína EbgA é uma lactase ineficaz e não permite o crescimento da lactose. Duas classes de mutações de ponto único melhoram dramaticamente a atividade da enzima ebg em relação à lactose. e, como resultado, a enzima mutante é capaz de substituir a lacZ β-galactosidase. EbgA e LacZ são 50% idênticos no nível do DNA e 33% idênticos no nível dos aminoácidos. A enzima ebg activa é um agregado de produtos do gene ebgA e do gene ebgC numa proporção de 1:1, sendo a forma activa das enzimas ebg um hetero-octámero α4β4.
Distribuição de espécies
Muito do trabalho realizado sobre a β-galactosidase é derivado de E. coli. No entanto, a enzima pode ser encontrada em muitas plantas (especialmente frutas), mamíferos, leveduras, bactérias e fungos. Os genes da β-galactosidase podem diferir no comprimento de sua sequência de codificação e no comprimento das proteínas formadas por aminoácidos. Isto separa as β-galactosidases em quatro famílias: GHF-1, GHF-2, GHF-35 e GHF-42. Coli pertence ao GHF-2, todas as plantas pertencem ao GHF-35 e Thermus thermophilus pertence ao GHF-42. Várias frutas podem expressar múltiplos genes de β-galactosidase. Existem pelo menos 7 genes de β-galactosidase expressos no desenvolvimento de frutos de tomate, que apresentam similaridade de aminoácidos entre 33% e 79%. Um estudo direcionado a identificar o amolecimento de frutas de pêssegos encontrou 17 expressões genéticas diferentes de β-galactosidases. A única outra estrutura cristalina conhecida da β-galactosidase é de Thermus thermophilus.